Um método otimizado para isolar epitélio uretral feminino de camundongos para análise de células únicas e imunofluorescência

Nosso grupo tem interesse em estudar o padrão epitelial no trato geniturinário. Esse protocolo representa um método otimizado para isolar o revestimento epitelial da uretra da fêmea do camundongo para análise molecular e celular posterior. Os métodos descritos neste artigo ajudarão na pesquisa sobre o revestimento uretral feminino e seu papel na defesa imunológica.

Para começar, coloque a camundonha CD1 eutanasiada, de 6 a 12 semanas de idade, em posição supina sobre a mesa de dissecação. Borrife 70% de etanol no abdômen para molhar o cabelo. Usando pinças, levante a pele do abdômen.

Depois, com uma tesoura pequena, faça uma incisão vertical em direção à parte inferior do corpo, terminando na abertura da uretra externa. Identifique a bexiga e levante-a suavemente com pinça, garantindo que esteja vazia e sem urina. Usando tesoura, corte a gordura e o tecido conjuntivo ao redor da bexiga para expor a estrutura em forma de borboleta onde os dois ossos pubianos se unem na sínfise púbica.

Observe a uretra passando por baixo da sínfise púbica. Depois, levante a sínfise púbica com pinças e corte-a com tesoura. Remova os fragmentos do osso púbico para expor a uretra fina que está na superfície ventral da parede vaginal.

Usando pinças finas, puxe suavemente a bexiga para cima a partir da cavidade corporal. Passe uma tesoura entre a uretra e a parede vaginal para separar os tratos urinário e reprodutivo. Mantenha uma leve tensão na bexiga enquanto corta ao longo da parte de trás da uretra para separá-la da parede vaginal.

Continue cortando até a abertura uretral distal para obter a uretra de camundongo de comprimento total, medindo de 1,2 a 1,5 centímetros de comprimento. Em seguida, separe a uretra da bexiga fazendo um único corte no pescoço da bexiga. Acumule quatro a cinco uretras em uma placa de Petri estéril contendo HBSS fresco, livre de cálcio e magnésio.

Sob um microscópio dissecante, corte a gordura e o tecido conjuntivo ao redor da uretra usando pinças finas e tesouras. Depois, com uma tesoura, corte cada uretra transversalmente em dois pedaços de tamanho igual. Coloque as peças de papel de seda sobre um peneiro de malha de nylon de 100 micrômetros.

Lave os pedaços de tecido com um mililitro de HBSS, depois transfira-os para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de 1% de tripsina preparado em HBSS suplementado com antibióticos e antimicóticos. Em seguida, incube a amostra em um rotador a 30 rotações por minuto e quatro graus Celsius por 15 a 30 minutos. Após a digestão, adicione 10 milimolares de cloreto de magnésio preparados em HBSS ao tubo, seguidos por 10 microgramas por mililitro de DNAse I preparada em PBS.

Incube o tubo por 15 a 30 minutos em um rotador colocado dentro de um forno de hibridização a 37 graus Celsius. Para extinguir a tripsina, transfira os tecidos uretrais para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 10% de soro de ovelha em HBSS em temperatura ambiente. Após cinco minutos, transfira os tecidos uretrais para um novo tubo contendo HBSS gelado, e depois para uma placa de Petri estéril contendo HBSS gelado.

Ao observar a amostra ao microscópio, segure uma extremidade da peça uretral com uma pinça. Usando outro par de pinças, passe ao longo de todo o comprimento da peça uretral para extrudir a folha epitelial transparente. Processe algumas das folhas epiteliais uretrais isoladas diretamente para imunocoloração de montagem completa para visualizar células epiteliais e macrófagos associados a epiteliais in situ.

Use uma pequena pipeta plástica para transferir as peças epiteliais em uma gota de HBSS isolada de quatro a cinco uretras de camundongos agrupadas para uma placa de Petri estéril. Use tesouras para triturar o epitélio em pequenos fragmentos. Transfira os fragmentos epiteliais picados para um tubo microcentrífuga de dois mililitros contendo 1,5 mililitros de solução digestiva pré-aquecida de Accutase a 37 graus Celsius.

Incube a amostra em um rotador a 37 graus por uma hora. Após a incubação, transfira todo o conteúdo para um tubo centrífugo de cinco mililitros contendo dois mililitros de tampão de lavagem composto por 1X PBS livre de cálcio e magnésio e 1% de BSA. Centrifuge a suspensão a 600 G por cinco minutos a quatro graus Celsius usando um rotor de balde oscilante.

Em seguida, aspire o sobrenadante usando um vácuo suave. Depois, use uma pipeta de filtro de um mililitro para resuspender o pellet em um mililitro de tampão de lavagem. Quebre o pellet pipetando para cima e para baixo até que os tufos fiquem menores.

Passe a suspensão por agulhas de calibre 23,5 e 26,5, cada uma presa a uma seringa de um mililitro usando quatro cursos para cada agulha. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem para umedecer a superfície de um filtro pré-separação de 30 micrômetros colocado sobre um tubo de cinco mililitros. Usando a seringa conectada à agulha de calibre 26,5, transfira um mililitro da suspensão da célula pelo filtro.

Depois, lave o tubo com um mililitro de tampão de lavagem e passe pelo filtro. Granule as células por centrifugação a 600 G por cinco minutos a quatro graus Celsius usando um rotor de balde oscilante. Aspire o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão de lavagem e adicione 100 microlitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Após exatamente três minutos, adicione quatro mililitros de tampão de lavagem e misture. Colhe as células por centrifugação a 600 G por cinco minutos a quatro graus Celsius usando um rotor de balde oscilante.

Remova o sobrenadante antes de resuspender o pellet em 50 a 200 microlitros de buffer de lavagem, dependendo do tamanho do pellet. Misture uma alíquota de cinco microlitros de células com cinco microlitros de azul de tripano e coloque a mistura em um hemocitômetro para avaliar o rendimento e a viabilidade celular. Avalie a viabilidade celular e quantifique populações celulares distintas usando citometria de fluxo.

Cultive células epiteliais unitais uretrais em uma matriz de membrana basal e meios de expansão organoides para gerar organoides epiteliais uretrais tridimensionais. Realize coloração por hematoxilina eosina e imunocoloração fluorescente em seções organoides embutidas para visualizar a estrutura organoide e a composição celular. As bainhas epiteliais uretrais isoladas apresentavam maior transparência do que o tecido estromal após a separação.

A imunocoloração de montagem completa das bainhas epiteliais mostrou forte marcação com o anticorpo E-cadherin CDH1. A rotulagem das folhas com o anticorpo contra F480 mostrou os macrófagos formando estruturas dendríticas ramificadas entre as células epiteliais da uretra. Células isoladas do epitélio uretral mostraram viabilidade consistentemente alta por exclusão de azul de tripano em hemocitômetro e citometria de fluxo usando o corante fantasma reativo a aminas V 450.

As células isoladas continham uma população celular epitelial enriquecida após a entrada das células vivas. Aproximadamente 1,3% das células imunes CD45 positivas e 1,18% de macrófagos foram observados nas suspensões unicelulares. Células epiteliais isoladas da uretra permaneceram viáveis e formaram organoides em uma matriz tridimensional, com crescimento organoide observado até o sexto dia em cultura.

A coloração por eosina por hematoxilina mostrou duas morfologias distintas dos organoides epiteliais uretrais, incluindo organoides grandes e ocos e organoides sólidos menores. Tanto os organoides epiteliais ocos quanto os sólidos da uretra foram estratificados e expressaram KRT5 e P63 na camada basal. Eles expressaram KRT-13 nas camadas celulares suprabasais e intermediárias.

Os organoides gerados pela uretra proximal apresentaram uma proporção maior de organoides ocos, enquanto os organoides da uretra distal formaram esferas mais sólidas. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem tipos de células uretrais e a capacidade autorrenovável das células epiteliais a partir da uretra proximal e distal. Uma das considerações mais importantes deste protocolo é a dissecação cuidadosa da uretra de comprimento total e a digestão enzimática ideal para obter células epiteliais uretrais viáveis para análise posterior.

As células epiteliais produzidas por esse protocolo podem ser usadas para múltiplas aplicações, incluindo sequenciamento de RNA unicelular, sequenciamento de RNA a granel, citometria de fluxo, imunocoloração e cultura de organoides.