Um modelo abrangente de RAT para avaliação de vias de transporte hepático por meio de amostragem simultânea linfática e vascular sanguínea

Nosso laboratório estuda o papel do sistema linfático em doenças inflamatórias e cardiometabólicas e desenvolve estratégias de administração de medicamentos para direcionar os linfáticos e tratar essas doenças. Esse protocolo permite a avaliação de processos hepáticos, incluindo metabolismo de medicamentos, fluxo de nutrientes, sinalização imune e resposta hepática sob diversas condições. Para começar, coloque um rato Sprague-Dawley macho anestesiado, pesando aproximadamente 250-300 gramas, que tenha sido canulado com sucesso via artéria carótida e veia jugular, em recumbência dorsal sob um microscópio cirúrgico.

Faça uma incisão horizontal de 4 a 5 centímetros da linha média até o flanco direito, aproximadamente 1,5 a 2 centímetros abaixo da caixa torácica. Retraa a pele e faça incisões correspondentes nos músculos oblíquos externo e interno. Cauterize ou liga quaisquer grandes vasos sanguíneos encontrados durante o procedimento.

Use cotonetes umedecidos com soro para mover o fígado em direção ao diafragma, o estômago à esquerda e o intestino delgado para baixo. Mantenha os órgãos retraídos com gaze embebida em soro. Identifique o ducto linfático hepático paralelo e levemente caudal à artéria hepática, medial ao rim direito e adjacente à veia cava inferior.

Use o ducto linfático mesentérico maior opaco ou branco como marco anatômico para identificar o ducto linfático hepático translúcido e estreito localizado caudalmente. Use pinças Graefe retas para remover o tecido conjuntivo que cobre o ducto linfático e a veia cava. Insira a pinça pela cama adiposa abaixo do rim direito para criar um túnel sob a veia cava.

Avance a pinça até que as pontas surjam paralelas ao ducto linfático hepático do lado oposto da veia cava. Use a pinça para segurar a extremidade externa da cânula pré-preparada e puxe a cânula pelo túnel até que sua ponta apareça do lado oposto. Use a pinça Hemostat do Mosquito Halsted para dobrar a ponta de uma agulha calibre 25 para aproximadamente 90 graus.

Usando a agulha dobrada, perfure cuidadosamente o ducto linfático hepático do lado direito mais próximo ao operador. Verifique a cânula pré-preenchida com solução anticoagulante e remova as bolhas de ar, se houver. Insira a extremidade chanfrada aproximadamente 2 milímetros dentro do duto.

Confirme o fluxo linfático na extremidade externa da cânula em aproximadamente 100 microlitros por hora. Ajuste ou reinsira a cânula se não houver fluxo. Tampe a cânula na extremidade coletora e depois aplique uma pequena gota de adesivo veterinário para fixar o local de inserção.

Quando o adesivo estiver seco, confirme o fluxo linfático pelo tubo. Depois, remova a gaze e devolve os órgãos às suas posições originais. Coloque o tubo de coleta contendo a solução anticoagulante abaixo da saída da cânula e confirme que a linfa está fluindo em gotas para dentro do tubo.

Depois, feche a parede abdominal suturando sequencialmente as camadas oblíqua interna, oblíqua externa e de pele. Imediatamente após a canulação linfática hepática, inicie a reidratação infundindo soro fisiológico estéril a 1,5-3,0 mililitros por hora através da cânula da veia jugular. Monitore a respiração e os reflexos enquanto mantém a anestesia por meio de um cone nasal.

Após a dosagem terapêutica pela cânula da veia jugular, colete linfa hepática continuamente em tubos contendo solução anticoagulante. Troque os tubos de coleta a cada hora ou conforme necessário. Colete amostras de sangue da artéria carótida em pontos de tempo designados, mantendo o volume total abaixo de 10% do volume sanguíneo circulante estimado antes da amostragem terminal.

Reabra a incisão abdominal para expor a cavidade abdominal superior, mantendo anestesia profunda e respiração estável. Use gaze umedecida com soro para retrair suavemente o fígado em direção ao diafragma, o estômago à esquerda e o intestino delgado para baixo. Identifique a artéria hepática que corre paralela ao ducto linfático hepático situado ao lado do ducto linfático mesentérico.

Obtenha uma cânula de polivinil com diâmetro externo de 0,61 milímetros e diâmetro interno de 0,28 milímetros pré-preenchida com uma solução anticoagulante e remova quaisquer bolhas de ar. Usando pinças curvas de íris, isole um pequeno segmento da artéria hepática. Coloque um ponto de seda 4-0 sob a artéria.

Levante delicadamente a artéria e coloque um segundo ponto distal à primeira. Amarre a sutura distal para controlar o retorno, deixando a sutura proximal solta para fechamento posterior. Usando uma tesoura micro de ponta fina, faça uma pequena incisão transversal de aproximadamente 0,5 milímetros na parede arterial entre os pontos.

Use a ponta da pinça Dumont para levantar a aba do vaso e estabilizar o lúmen do vaso para a inserção da cânula. Insira a extremidade chanfrada da cânula de polivinil na abertura e avance a cânula aproximadamente 2-3 milímetros. Assegure a cânula amarrando o ponto proximal ao redor tanto do vaso quanto da cânula.

Confirme a colocação correta aspirando suavemente uma pequena quantidade de sangue arterial vermelho brilhante. Colete de 0,5 a 1 mililitro de sangue em um tubo pré-marcado contendo anticoagulante. A recuperação linfática de terapias macromoleculares administradas por via intravenosa em linfa torácica, hepática e mesentérica demonstra a utilidade do modelo para avaliar o transporte linfático.

A linfa hepática tem um teor lipídico total marcadamente menor do que a linfa torácica e mesentérica, enquanto sua concentração de proteínas é comparável à das outras fontes linfáticas. Esse protocolo permite medições simultâneas da linfa hepática e do sangue para avaliar o transporte, metabolismo e eliminação de moléculas, incluindo medicamentos, nutrientes e sinais. A canulação precisa do ducto linfático hepático é tecnicamente desafiadora e requer identificação anatômica cuidadosa e técnica cirúrgica.

Estudos futuros podem usar essa técnica para mapear o transporte, a eliminação e o metabolismo hepático, avançando o entendimento sobre doenças hepáticas e terapias direcionadas.