Um Método Integrado para Modelagem de AVC Fototrombótico e Registro In Vivo de Optrode da Atividade Neuronal e Astrocítica em Ratos Comportando-se
29 de maio de 2026
Esse protocolo oferece um método integrado que inclui entrega viral, implantação de optrodo, indução fototrombótica, registro simultâneo da atividade de astrócitos e neurais, e estimulação optogenética de astrócitos. Esse método integrado visa fornecer investigação simultânea da relação astrócito-neurônio nos estágios agudo a crônico do AVC isquêmico.
Nossa pesquisa desenvolve um método integrado para registrar simultaneamente a atividade de astrócitos e neurônios durante acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos conscientes. Métodos anteriores registravam neurônios ou astrócitos separadamente. Nosso protocolo capta sinais de astrócitos e neurônios simultaneamente desde os primeiros momentos do início do acidente vascular cerebral.
Para começar, transfira um camundongo C57BL/6J profundamente anestesiado para o estereotáxico equipado com uma máscara de anestesia. Monitore a profundidade da anestesia a cada 10 minutos, mantendo a temperatura corporal do camundongo entre 36 e 37,5 graus Celsius com um tapete aquecido com controle de feedback. Prenda o camundongo ao estereotáxico com barras auriculares e uma barra bucal após aplicar pomada oftálmica nos olhos.
Confirme a imobilização da cabeça mediante leve sondagem assim que a cabeça estiver fixada simetricamente. Após a depilação e a preparação asséptica da pele, use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão mediana. Limpe o periósteo com soro fisiológico e cotonetes para expor o bregma e o lambda.
Abaixe a micropipeta de vidro para tocar sucessivamente o bregma e o lambda. Após anotar a coordenada Z no paquímetro digital, ajuste a barra bucal até que a diferença seja inferior a 0,04 milímetros. Abaixe a micropipeta de vidro para tocar o bregma e redefina o paquímetro digital para zero.
Mova a micropipeta sucessivamente 2,3 milímetros para a esquerda e para a direita em relação ao bregma. Após anotar a coordenada Z, ajuste as barras auriculares até que as diferenças bilaterais sejam inferiores a 0,04 milímetros. Após redefinir o paquímetro digital para zero no bregma, marque a área da região do membro anterior da córtex motora em ântero-posterior mais 1,5 milímetros e médio-lateral mais 0,74 milímetros.
Use uma microbroca e brocas de ponta redonda de 0,5 milímetro para fazer um pequeno orifício, com aproximadamente 0,5 milímetro de diâmetro no local marcado. Antes da carga, misture os dois vetores virais adeno-associados em volumes iguais e centrifugue brevemente a amostra. Abaixe a micropipeta de vidro conectada à bomba de microinfusão até o local-alvo a uma profundidade dorsoventral de menos 0,94 milímetro a partir da superfície do cérebro.
Infundir 400 nanolitros da mistura viral contendo 200 nanolitros de cada vetor a uma taxa de 50 nanolitros por minuto. Retirar lentamente a pipeta 10 minutos após a conclusão da infusão. Suturar o couro cabeludo com sutura 4-0 de 20 milímetros, curva 3/8, e colocar o camundongo sobre uma placa aquecida até a recuperação completa.
Três a quatro semanas após a injeção viral, siga o procedimento previamente demonstrado até a incisão no couro cabeludo. Durante a incisão, remova um quadrado de 1,5 centímetro por 1,5 centímetro do couro cabeludo, mantendo pele suficiente ao redor dos olhos. Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio e solução salina a 0,9%.
Após identificar o bregma, redefina o paquímetro digital para zero. Utilize uma broca de ponta redonda de 0,8 milímetro para levemente rugosizar a superfície do crânio. Marque a área do córtex motor da extremidade anterior.
No eixo anterior-posterior, 1,5 milímetros, e no eixo medial-lateral, 0,74 milímetros. Utilize a marca como ponto central para desenhar um quadrado de cinco milímetros por cinco milímetros. Use uma microfresadora a aproximadamente 10.000 rotações por minuto para traçar o quadrado.
Aplique continuamente solução salina gelada ao longo do trajeto da broca e pare imediatamente se o retalho ósseo afrouxar. Faça três pequenos furos de 0,5 milímetro de diâmetro sobre o hemisfério contralateral e o cerebelo. Implante parafusos de cranioplastia nos furos.
Certifique-se de que cada parafuso alcance a dura-máter, mas não penetre além, para evitar danos ao tecido cerebral. Use pinças para remover o retalho ósseo solto. Utilize pinças ultrafinas com ponta ultrafina menor que 0,03 milímetros por 0,01 milímetros para remover a dura-máter na janela craniana, evitando contato direto com o tecido cerebral.
Fixe o optrodo ao braço do micromanipulador do estereotáxico e mova-o acima da janela craniana. Entrelace firmemente os fios de prata de terra e de referência do optro aos três parafusos de cranioplastia. Limpe a superfície da janela craniana com solução salina estéril.
Abaixe lentamente o optrod até a profundidade dorsoventral desejada de menos 0,94 milímetros a uma taxa de um milímetro a cada 10 segundos. Aplique uma camada de agarose sobre a janela craniana após o implante. Aplique três a quatro camadas de cimento dental.
Uma vez que o cimento dental solidifique, forneça analgesia por três a cinco dias e permita que o camundongo se recupere por uma a duas semanas. Utilize um sistema de fotometria com fibra de comprimento de onda duplo ou triplo para excitar a GCaMP6s. Ajuste o canal de sinal para 470 nanômetros e o canal de controle para 410 nanômetros.
Ajuste a taxa de amostragem para 60 quadros por segundo. Agora, aterre corretamente todos os componentes do sistema de gravação. Utilize um referencial mediano comum durante a gravação.
Verifique se os sinais de banda ampla e potenciais de campo locais estão selecionados no software de gravação, monitorando continuamente a presença de ruído durante toda a sessão de gravação. Após anestesiar brevemente o camundongo, conecte o optro à linha de gravação por meio de um adaptador. Coloque o camundongo em um ambiente semelhante à gaiola de alojamento para a gravação.
Permita 10 minutos de aclimatação após o despertar. Registre o camundongo realizando o teste de força de preensão, exigindo um puxão por minuto durante cinco minutos. Marque com carimbo de tempo os testes comportamentais com precisão tanto nos sistemas multicanal quanto de fotometria com fibra.
Administre uma solução de corante Bengala Rosa a 1,5% por via intraperitoneal na dose de 10 a 20 miligramas por quilograma e aguarde cinco minutos. Conecte a sonda optrodica à fonte a laser assim que a anestesia profunda for alcançada e mantida. Aplique um feixe de laser de 530 nanômetros a 15 miliwatts através do optrodo implantado por cinco a oito minutos para induzir isquemia focal.
Para realizar a estimulação optogenética, conecte o estimulador a laser ao optrodo. Ligue o estimulador a laser optogenético de 488 nanômetros e configure-o em 10 miliwatts por cinco minutos para o Opto-vTrap. Por fim, coloque o camundongo sobre uma placa aquecida para recuperação.
Em comparação com a linha de base, o fluxo sanguíneo cerebral diminuiu após a fototrombose e permaneceu suprimido em um dia e sete dias após o acidente vascular cerebral. A força de preensão da pata dianteira apresentou uma diminuição altamente significativa em um dia e permaneceu suprimida em sete dias após o acidente vascular cerebral. Os transientes de cálcio astrocitários registrados por fotometria de fibra e os potenciais de ação neuronais obtidos por eletrofisiologia foram alinhados com base nos carimbos de tempo.
Após o acidente vascular cerebral foto-trombótico, as taxas de disparo foram significativamente suprimidas tanto em neurônios piramidais quanto em interneurônios, em comparação com a atividade de disparo basal durante a tarefa de preensão da pata dianteira. Na linha de base, os transientes de cálcio em astrócitos atingiram o pico entre quatro e seis segundos após o início da tarefa. No entanto, a amplitude foi significativamente reduzida após o acidente vascular cerebral foto-trombótico, refletindo uma atividade de cálcio enfraquecida.
Os gráficos de raster e os histogramas peri-estimulação temporal mostraram alterações na atividade neuronal durante a estimulação óptica. Tanto as taxas de disparo dos neurônios piramidais quanto das interneurônios exibiram uma diminuição significativa após a estimulação óptica em comparação com a linha de base pré-estimulação, confirmando que a modulação astrocitária tem um efeito mensurável downstream na excitabilidade do circuito local. Este protocolo permite o registro ininterrupto do exercício e da neuroatividade ao longo da linha do tempo anterior ao acidente vascular cerebral, desde a fase aguda até a fase crônica.
O sucesso neste protocolo depende do alinhamento preciso ou coordenado. A implantação do optrodos monocular e a expressão viral suficiente são aspectos temporais críticos ao longo das cirurgias. Estudos futuros poderiam utilizar múltiplos implantes para monitorar regiões cerebrais mais amplas ou direcionar diferentes tipos celulares com ensaios comportamentais diversos.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um método integrado para investigar as interações entre astrócitos e neurônios após acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos acordados e em comportamento ativo. Ao combinar a indução de acidente vascular cerebral por fotoindução com eletrofisiologia multicanal simultânea e fotometria por fibra óptica utilizando um optrodo personalizado, a abordagem permite gravações multimodais em tempo real da atividade neuronal e astrócita durante tarefas comportamentais. O método supera limitações de técnicas anteriores ao permitir a indução, gravação e manipulação optogenética simultâneas, sem a necessidade de múltiplas cirurgias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa em acidente vascular cerebral
- Eletrfisiologia
- Optogenética
Contexto
- As dinâmicas entre astrócitos e neurônios são fundamentais para a recuperação pós-acidente vascular cerebral.
- Os métodos existentes frequentemente não possuem a capacidade de monitorar interações em tempo real durante o comportamento.
- A patologia da fase aguda do acidente vascular cerebral é difícil de estudar com abordagens tradicionais.
- A gravação e manipulação simultâneas de ambos os tipos celulares em animais conscientes é tecnicamente desafiadora.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para gravação em tempo real e multimodal da atividade de astrócitos e neurônios após acidente vascular cerebral.
- Permitir a investigação das fases aguda e crônica do acidente vascular cerebral em camundongos conscientes.
- Validar a capacidade do sistema de manipular e monitorar as interações entre astrócitos e neurônios.
Métodos Utilizados
- Indução fototrombótica de isquemia focal na córtex de camundongo.
- Eletrfisiologia multicanal simultânea para registrar potenciais de ação neuronais.
- Fotometria de fibra para monitorar transientes de cálcio em astrócitos.
- Optrodo personalizado para indução fototrombótica, registro e manipulação optogenética simultâneos.
Resultados Principais
- Gravação simultânea bem-sucedida de sinais de cálcio em astrócitos e descargas neuronais em camundongos acordados e em comportamento ativo.
- A estimulação optogenética de astrócitos resultou em reduções mensuráveis na frequência de disparos tanto de neurônios piramidais (em 1,55 ± 0,45 Hz) quanto de interneurônios (em 3,64 ± 1,37 Hz; n = 2).
- O sistema permite a investigação das interações entre astrócitos e neurônios em tempo real durante tarefas comportamentais.
- Resultados representativos validam a abordagem integrada para pesquisas sobre acidente vascular cerebral.
Conclusões
- O protocolo preenche uma lacuna metodológica crítica na pesquisa de acidente vascular cerebral.
- Permite a investigação em tempo real e multimodal das interações celulares desde as fases agudas até as crônicas do acidente vascular cerebral.
- A abordagem facilita estudos da dinâmica entre astrócitos e neurônios durante o comportamento, avançando o entendimento dos mecanismos de recuperação pós-AVC.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A investigação em tempo real e multimodal das interações entre astrócitos e neurônios em animais conscientes aborda uma lacuna crítica na pesquisa pré-clínica de acidente vascular cerebral. Este método integrado aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas em vias neurovasculares e neuroinflamatórias. A abordagem sustenta a continuidade translacional das fases aguda à crônica do acidente vascular cerebral, orientando decisões em portfólios de descoberta de fármacos para o sistema nervoso central.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a testagem direta de hipóteses sobre interações neurogliais em modelos relevantes para doenças.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao associar a modulação astrocitária a alterações na atividade neuronal.
- Facilita a validação funcional de alvos em vias de sinalização de astrócitos e neurônios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma validada para leituras quantitativas e simultâneas da atividade neuronal e astrocítica.
- Permite avaliação reprodutível de intervenções farmacológicas ou genéticas em tempo real.
- Apóia a padronização de ensaios para triagem de alto conteúdo de compostos neuroativos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos com mecanismos relevantes à doença humana, capturando dinâmicas de acidente vascular cerebral agudo e crônico.
- Permite estudos longitudinais dos efeitos de intervenções sobre interações celulares durante o comportamento.
- Melhora o avanço ajustado ao risco ao fornecer biomarcadores preditivos e multimodais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra a fase inicial de descoberta e a validação pré-clínica, permitindo a análise em tempo real, in vivo, da dinâmica neuroglial após acidente vascular cerebral em camundongos conscientes.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre sinalização entre astrócitos e neurônios e modulação de vias após lesão isquêmica.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para triagem de compostos ou genética em um contexto fisiologicamente relevante.
- Análises: Fornece simultaneamente dados de imageamento de cálcio e eletrofisiológicos para comparação estatística robusta dos efeitos de intervenções.
- Pesquisa Translacional: Facilita a correlação entre achados pré-clínicos e desfechos clínicos por meio da modelagem das fases aguda e crônica do acidente vascular cerebral.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para diversos modelos de doenças do sistema nervoso central que exigem interrogatório multimodal em tempo real.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurovasculares.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho ao integrar indução, registro e manipulação em um único procedimento.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avanço ou interrupção por meio de dados robustos e clinicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos do SNC ao fornecer leituras com alto conteúdo e relevância para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia in vivo, fotometria de fibra e optogenética.
- Exige instrumentação especializada, incluindo optrodos personalizados e sistemas de gravação sincronizados.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos de aquisição e análise de dados.
- A adaptação a outros modelos de doenças do SNC pode exigir otimização do protocolo.
- Limitações potenciais incluem a complexidade técnica e a necessidade de treinamento comportamental dos modelos animais.
