Um Sistema Microfluídico para Modelagem de Disfunção Endotelial sob Estresse Fisiológico Combinado de Cisalhamento Pulsátil e Hiperglicemia Oscilatória

Este estudo investiga como a hiperglicemia oscilatória sincronizada e o estresse de cisalhamento pulsátil juntos impulsionam a disfunção endotelial na doença vascular diabética. Modelos existentes utilizam glicose inicial alta ou fluxo laminar constante. Investigamos como o estresse de cisalhamento pulsatil contrabalança a lesão oscilatória da glicose.

Para começar, utilize software de projeto assistido por computador para projetar a estrutura do chip microfluídico. Faça o molde mestre do SU-8 através de uma empresa comercial. Em uma xícara limpa, misture o agente de cura do polidimetilsiloxano e o pré-polímero em uma proporção de 10:1 em peso e mexa vigorosamente a mistura à mão por cinco minutos.

Depois, coloque o recipiente em uma câmara de vácuo a uma pressão de 0,08 megapascal por pelo menos 15 minutos para remover bolhas de ar presas durante a mistura. Despeje o polidimetilsiloxano sobre a pastilha colocada em uma placa de Petri de vidro. Desgasifice o polidimetilsiloxano derramado sobre a pastilha em um dessecador por mais 15 minutos para remover quaisquer bolhas formadas durante a colagem.

Coloque a placa de Petri contendo o molde e o polímero em um forno quente ajustado a 80 graus Celsius por duas horas. Usando um bisturi, descasque cuidadosamente a laje de polímero solidificada do molde mestre. Usando uma ferramenta de perfuração de núcleo, crie as portas de entrada e saída nas extremidades designadas dos canais na laje de polímero.

Limpe a lâmina de vidro da tampa e a face padronizada da laje de polímero com fita adesiva. Em seguida, trate tanto a laje de polímero quanto a lâmina da tampa de vidro com um limpador de plasma a 65 watts sob ar ambiente por 60 segundos. Alinhe imediatamente a face do canal polimérico com o lado tratado do lâmina de vidro.

Depois, pressione suavemente para criar um canal microfluídico permanentemente fechado. Coloque o chip microfluídico ligado em uma garrafa de vidro boronizada cheia de água desionizada. Esterilize por autoclave a 121 graus Celsius e 15 libras por polegada quadrada por 20 minutos.

Coloque o chip esterilizado em um recipiente de cultura de 60 milímetros preenchido com uma mistura equimolar de PBS e DMEM de baixo glicemia. Depois, usando uma seringa de um mililitro, introduza 100 microgramas por mililitro de fibronectina no canal e incube a 37 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, adicione 24,5 milimolares de demanitol ao DMEM de glicose baixa para elevar a pressão osmótica.

Adicione cinco milimolares de glicose D a um DMEM de glicose elevado para obter uma concentração final de 30 milimolares de glicose. Prepare meio de cultivo de glicose normal e meio de cultura de glicose alta, suplementado com 20% de FBS e 1% de penicilina estreptomicina. Depois, morno PBS, tripsina, meio de cultivo de glicose normal e meio de cultura de glicose alta em banho-maria a 37 graus Celsius.

Colhe as células endoteliais da veia umbilical humana do prato de cultivo com confluência de 90%. Desprenda as células usando solução 0,25% de tripsina-EDTA. Após incubar as células a 37 graus Celsius por 30 segundos, conte as células colhidas e re-suspenda-as separadamente em glicose normal e meios de glicose alta a uma concentração de 1 vezes 10 com potência de 6 células por mililitro.

Usando uma seringa de um mililitro, injete 100 microlitros da suspensão celular na entrada do chip microfluídico com meio glicosico normal para o grupo controle e meio de glicose alta para o grupo experimental. Coloque os chips microfluídicos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Calcule a taxa de fluxo necessária para alcançar a tensão de cisalhamento pulsátil alvo usando a equação apresentada.

Conecte a fonte de pressão ao controlador de pressão. Depois, conecte o controlador de pressão ao controlador de válvula conectado ao computador para controle automatizado das formas de onda de pressão. Preencha dois reservatórios de 100 mililitros, um com meio de cultivo de glicose normal e outro com meio de cultivo de glicose de alto teor de glicose.

Conecte os reservatórios aos canais correspondentes do controlador de pressão. Depois, conecte os reservatórios e a válvula magnética de duas posições triviais usando tubos de silicone. Defina o esforço fisiológico de cisalhamento pulsátil alvo correspondente a uma vazão de aproximadamente 200 microlitros por minuto.

Programe a bomba de ar programável para gerar uma função de onda senoidal para manter a tensão de cisalhamento pulsátil. Em seguida, programe o controlador da válvula para trocar de canal a cada cinco minutos para gerar uma oscilação de glicose em onda quadrada durante a estimulação dinâmica. Ligue a válvula magnética de duas posições e três vias e o chip microfluídico usando tubos de silicone.

Depois, inicie o sistema de bombas programáveis para preparar o tubo. Em seguida, usando os conectores de aço inoxidável com ângulo de 90 graus de diâmetro e 1,3 milímetro, conecte as portas de entrada e saída do chip microfluídico ao tubo. Conecte a saída do chip microfluídico ao reservatório de resíduos e então ligue a bomba novamente para fornecer a tensão de cisalhamento oscilatória combinada de glicose oscilatória e pulsátil por um total de 30 minutos.

Após a verificação do campo de fluxo, prepare a solução de trabalho de calceína AM e iodeto propidiano conforme as instruções do fabricante no ponto final experimental. Depois de enxaguar o canal uma vez com PBS, introduza a solução de trabalho de calceína AM e iodeto de propidio no canal e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos no escuro. Capture imediatamente imagens fluorescentes das células coradas usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lente objetiva 10 vezes.

Capture imediatamente imagens fluorescentes das células coradas usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lente objetiva 10x. Use o filtro verde de isotiocianato de fluoresceína para calceína AM e o filtro vermelho de tetrametilrodamina ou rodamina para iodeto de propidium. Após lavar o canal três vezes com PBS, introduza a solução fluorescente fluorescente de estresse oxidativo de célula viva no canal e incube, como demonstrado anteriormente.

Lave o canal três vezes com PBS para remover a sonda não ligada. Capture imediatamente imagens fluorescentes usando o filtro vermelho distante configurado por uma lente objetiva 20x, mantendo parâmetros de exposição idênticos em todos os grupos. Abra as imagens adquiridas de calceína AM verde e vermelho de iodeto de propidio na ImageJ.

Ajuste manualmente o limiar para cada canal para distinguir sinais fluorescentes de fundo. Use o contador de células para quantificar células fluorescentes, ajustando o tamanho mínimo da célula com base em observações para determinar a contagem de células vivas e mortas em múltiplos campos de visão. Calcule a porcentagem de células vivas usando um software de planilha para cada condição experimental.

Depois, calcule a média e o desvio padrão em múltiplos campos de visão usando software de análise estatística para comparar grupos. Arraste a imagem escolhida para o ImageJ. Selecione Analisar e selecione Definir Escala para calibrar o tamanho do pixel usando os metadados do microscópio.

Depois, remova o sinal uniforme de fundo inespecífico de toda a imagem usando a função de subtração de fundo selecionando Processo e escolhendo Subtrair Fundo. Em seguida, selecione Imagem e escolha Ajustar seguido de Limiar para ajustar manualmente o controle deslizante de limiar e definir o sinal de espécie reativa de oxigênio intracelular. Defina as medições selecionando Analisar e escolhendo Ajustar Medidas para incluir Área e Valor cinza médio.

Selecione Analisar e Analisar Partículas para determinar o tamanho mínimo da célula com base nas dimensões observadas e medir a intensidade média do sinal segmentado dentro do ROI da monocamada da célula. Relate o nível de espécie reativa de oxigênio para cada condição experimental como a média dos valores medidos derivados de pelo menos três campos de visão selecionados aleatoriamente por chip. Insira os resultados quantitativos em softwares de análise de dados e gráficos.

Determine a significância estatística comparando grupos experimentais com o grupo controle usando análise bidirecional da variância, seguida pelo teste pós-hoc de Tukey com nível de significância de 0,05. Use o software para realizar a análise e gerar gráficos com barras de erro representando o desvio padrão. Imagens representativas de fluorescência mostraram uma alta proporção de células viáveis em todos os grupos, com morte celular negligenciável observada na glicose normal e glicose normal com grupos de tensão de cisalhamento pulsátil, enquanto a glicose oscilatória e a glicose oscilatória com grupos de tensão de cisalhamento pulsátil exibiram um aumento visível nas células mortas.

A análise quantitativa mostrou que a exposição oscilatória à glicose resultou em uma redução significativa da viabilidade celular em comparação ao grupo controle, e a aplicação de tensão de cisalhamento pulsátil sob condições oscilatórias de glicose aumentou significativamente a viabilidade em comparação com a glicose oscilatória isolada. Em condições normais de glicose, os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio eram baixos e ainda mais reduzidos após a aplicação do estresse de cisalhamento. Enquanto as condições oscilatórias de glicose causaram um aumento marcado na intensidade da fluorescência vermelha, indicando elevação das espécies reativas de oxigênio.

O aumento oscilatório induzido pela glicose nas espécies de oxigênio reativas intracelulares foi reduzido após a aplicação do estresse de cisalhamento. A análise quantitativa revelou que o estresse de cisalhamento reduziu significativamente os níveis de espécies reativas de oxigênio sob condições normais de glicose. Em contraste, condições oscilatórias de glicose levaram a um aumento significativo nos níveis de espécies reativas de oxigênio em comparação com a glicose normal.

Além disso, o estresse de cisalhamento diminuiu significativamente os níveis de espécies reativas de oxigênio, mesmo sob condições oscilatórias de glicose. Esse protocolo permite quantificar os níveis de ROS e a disponibilidade celular para estudar a disfunção endotelial sob hiperglicemia oscilatória e o estresse de cisalhamento pulsátil. Após esse procedimento, análises moleculares, como a via NRF2 ou sinalização iNOS, podem ser realizadas para enuclear mecanismos de proteção endotelial.

Estudos futuros podem usar esse sistema para explorar vias mecanobiológicas, incorporar geometrias de perturbação do fluxo ou co-cultura de células musculares lisas.