Caracterização das Sondas de Riboglow In Vitro como Base para Imagens de Vida Fluorescente em Células Vivas de Mamíferos e Modelos Celulares Tridimensionais
4 de agosto de 2026
O objetivo deste protocolo é possibilitar a medição quantitativa da vida útil da fluorescência das sondas Riboglow para fluxos de trabalho de imagem de RNA reprodutíveis in vitro, em células vivas de mamíferos e em modelos celulares tridimensionais. Descrevemos os fluxos de trabalho de preparação de amostras, entrega de sondas, aquisição de dados e análise quantitativa para extração de medições de vida útil de fluorescência imparciales.
Nossa pesquisa se concentra na visualização do RNA em células vivas para investigar a dinâmica espaço-temporal do RNA. A plataforma Riboglow usa microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência quantitativa em sistemas multicelulares aplicáveis a sistemas biológicos em saúde e doença. Para começar, obtenha as amostras de RNA ou células com sondas Riboglow carregadas com contas.
Ligue o sistema de microscópio de varredura confocal a laser seguido pela unidade de controle do microscópio. Ligue o sistema de microscopia de tempo de vida de fluorescência baseado em contagem de fótons únicos correlacionados no tempo ou microscopia FLIM, incluindo a unidade de combinação de laser, o detector do fotomultiplicador e o temporizador de eventos. Após abrir o software de aquisição e análise de imagem NIS, na janela de configuração e configuração, selecione AX com PicoQuant.
Depois que o software inicializou, selecione AX FLIM e FCS. Para configurar o microscópio para aquisição de dados de tempo de vida de fluorescência, confirme se o Galvano está selecionado na seção AX pad. Configure o valor de média para um e o tempo de permanência para dois.
Na seção de potência do laser, reduza os controles deslizantes individuais do laser para 3 a 4% e configure o controle deslizante de todos os lasers para um. Após selecionar o objetivo de 20X, nas configurações da área de varredura, selecione 512 por 512 e ligue os detectores. Para definir o caminho do arquivo de dados, vá para o final da seção do controlador e selecione configurar.
Após clicar na aba PicoQuant ou FLIM FCS, sob o caminho do espaço de trabalho, selecione o símbolo da pasta à direita. No local de armazenamento, crie uma nova pasta para os experimentos do dia e feche a janela de configuração. Uma vez selecionado ao vivo e a janela de aquisição de imagem aparecer, selecione ao vivo novamente para pausar a coleta de fótons.
Para configurar as janelas de coleta de dados de microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência ou FLIM, clique com o botão direito na janela da imagem ao vivo e selecione o plug-in PicoQuant. Ative mostrar curva de decaimento, mostrar traço de tempo e mostrar estatísticas FLIM. Para configurar a disposição do laser para o experimento celular, vá para as configurações do experimento no canto superior direito da página, próximo aos lasers.
Após clicar em adicionar ao lado da caixa de corante multicanal, adicione os corantes desejados. Selecione o modo expert. Ajuste as atribuições do detector para cada espectro de emissão.
Roteie os espectros de excitação e emissão sobrepostos para diferentes detectores. No painel da esquerda, ajuste a ordem de passagem para minimizar a interferência entre corantes com espectros de excitação e emissão sobrepostos. Após salvar e nomear a nova configuração do laser, selecione a configuração salva para o experimento.
Clique com o botão direito na janela de aquisição ao vivo. Escolha controles de aquisição e, em seguida, selecione visão geral XYZ. Antes de carregar o prato de cultura de células de imagem para FLIM, adicione o corante nuclear de células vivas e misture completamente, girando suavemente no banco e reserve por 30 segundos.
Coloque o prato de imagem no palco do microscópio. Empurre o prato para o canto inferior esquerdo do palco do microscópio. Cole o amostra no palco quando estiver usando objetivos não aéreos para evitar o desvio XY.
Alterne para o canal 4'6-Diamidino-2-fenilindo ou DAPI. Use o botão do controlador até que os núcleos das células fiquem em foco. Se necessário, ajuste a sensibilidade do botão de altura Z e, se as células não aparecerem na visualização, ajuste as coordenadas XY.
Para ativar o sistema de foco perfeito ou o foco automático PFS, no lado direito do painel AX, selecione a lupa ao lado do botão PFS. Uma vez que o microscópio tenha normalizado automaticamente a altura Z, confirme se o botão PFS está iluminado e exibe em foco. Usando o detector AX, encontre as células desejadas usando o canal DAPI.
Em seguida, alterne para o canal ATO 590 para identificar efetivamente as células carregadas com contas. Uma vez que uma célula é identificada e centralizada com um clique duplo, alterne para AX FLIM e FCS. Certifique-se de que 512 por 512 esteja selecionado, ajuste o tamanho do quadro clicando e arrastando os cantos para ajustar à célula.
Permita que o quadro redimensionado fique vermelho. Clique com o botão direito dentro do quadro ou selecione ao vivo até que o quadro fique verde para confirmar o ajuste. Após ajustar o número de capturas para o valor desejado, selecione capturar.
Observe a nova janela de captura e a caixa de progresso de captura no lado direito da tela. Uma vez que o software de análise FLIM esteja aberto, navegue até o caminho de arquivo correto. Observe as aquisições preenchendo automaticamente a janela do software de análise.
Renomeie as aquisições conforme forem coletadas. Quando a captura estiver completa, volte ao detector AX. Selecione ao vivo para procurar uma nova célula.
Ajuste o tamanho da janela de AX FLIM e espectroscopia de correlação de fluorescência ou FCS conforme necessário para células maiores ou menores. Após adquirir novas células durante o período de imagem de três horas, exporte o arquivo sptw criado. Prossiga com o processamento e análise de dados FLIM para extrair as medidas de tempo de vida de fluorescência dos amostras coletadas.
Curvas de decaimento representativas mostraram que a presença da etiqueta A de RNA aumentou o tempo de vida da fluorescência extraída in vitro, enquanto as amostras sem a etiqueta A de RNA mostraram curvas de decaimento deslocadas para a esquerda, indicando valores de tempo de vida médios mais curtos. Os tempos de vida de fluorescência celular das células carregadas com contas com 3xGly foram significativamente mais baixos do que os carregados com 5xGly. Curvas de decaimento representativas mostraram que as células carregadas com 3xGly tinham curvas de decaimento deslocadas para a esquerda em comparação com as células carregadas com 5xGly, indicando valores de tempo de vida médios de fluorescência mais baixos.
O núcleo das células carregadas com sonda Riboglow consistentemente mostrou tempos de vida de fluorescência mais altos do que o citosol da mesma célula. A janela de aquisição de escala de cores falsa, as curvas de decaimento e os valores médios extraídos de amplitude tau todos mostraram a mesma tendência de tempo de vida de fluorescência. Este protocolo permite que os pesquisadores determinem o tempo de vida de fluorescência de moléculas fluorescentes em diferentes contextos biológicos.
Os pesquisadores podem realizar análise de dados quantitativa e avaliar variáveis de interesse seguindo este procedimento, incluindo a adição de ligantes de RNA. Estudos futuros podem aplicar Riboglow FLIM a modelos de doenças, expandir as capacidades de multiplexação e rastrear dinâmica de RNA em sistemas animais vivos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para o Riboglow-FLIM, um sistema de biossensor de RNA codificado geneticamente que permite a visualização quantitativa de moléculas de RNA em células mamíferas vivas utilizando microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM). O fluxo de trabalho abrange o preparo da amostra, a aquisição de imagens e a análise quantitativa, facilitando o estudo da dinâmica e das interações do RNA em ambientes controlados e em células vivas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia do RNA
- Imagem em células vivas
- Microscopia de fluorescência
Contexto
- A maior parte do genoma humano é transcrita em RNAs não codificantes, que desempenham diversas funções regulatórias.
- A visualização quantitativa de RNA em células vivas é essencial para compreender a dinâmica do RNA, mas ainda representa um desafio técnico.
- Riboglow é uma plataforma de biossensor de RNA que utiliza um aptâmero de RNA curto que se liga a uma sonda de molécula pequena para gerar um sinal de tempo de vida de fluorescência.
- A microscopia de tempo de vida de fluorescência (FLIM) permite a detecção desses sinais, possibilitando a obtenção de imagens quantitativas de RNA em ambientes celulares complexos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo abrangente para a implementação do Riboglow-FLIM in vitro e em células vivas de mamíferos.
- Permitir a detecção e análise quantitativas de RNA com base no tempo de vida da fluorescência.
- Destacar considerações fundamentais para a visualização reprodutível e precisa de RNA utilizando este método.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras de RNA ou células vivas carregadas com microesferas utilizando sondas Riboglow.
- Configuração e calibração do microscópio confocal de varredura a laser e do sistema FLIM.
- Aquisição de dados de tempo de vida de fluorescência utilizando configurações específicas de laser e detector.
- Análise quantitativa de conjuntos de dados FLIM, incluindo extração de curvas de decaimento e análise de regiões subcelulares.
Resultados Principais
- In vitro, a presença da marcação de RNA A aumentou o tempo de vida da fluorescência, enquanto sua ausência resultou em tempos de vida mais curtos.
- Em células vivas, a carga com microesferas contendo diferentes variantes da sonda Riboglow (por exemplo, 3xGly versus 5xGly) produziu assinaturas distintas de tempo de vida da fluorescência.
- O núcleo apresentou consistentemente tempos de vida de fluorescência mais altos do que o citosol dentro da mesma célula.
- A imagem em cores falsas, as curvas de decaimento e os valores de amplitude extraídos corroboraram as tendências observadas nos tempos de vida da fluorescência.
Conclusões
- O Riboglow-FLIM permite uma avaliação robusta e quantitativa da localização e dinâmica de RNA em células vivas.
- O protocolo oferece suporte à implementação reprodutível e à análise precisa de dados em diferentes contextos biológicos.
- Essa abordagem pode ser estendida a modelos de doenças, imagens multiplexadas e estudos em animais vivos em pesquisas futuras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização quantitativa de RNA em células mamíferas vivas representa um desafio fundamental para a descoberta precoce de fármacos, especialmente para compreender a dinâmica de RNA não codificantes e mecanismos regulatórios. O fluxo de trabalho Riboglow-FLIM permite medições robustas e reproduzíveis da localização e interações de RNA em ambientes celulares complexos, oferecendo confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Essa capacidade fortalece a continuidade translacional, desde a descoberta até a pesquisa pré-clínica, ao fornecer dados quantitativos e com resolução espacial sobre RNA.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da localização e dinâmica de RNA em células vivas para a validação funcional de alvos.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao quantificar interações entre RNA e sondas e a distribuição subcelular.
- Oferece confiança preditiva para hipóteses terapêuticas direcionadas ao RNA por meio de medições quantitativas de tempo de vida.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece ensaios de imagem quantitativos validados para detecção de RNA em sistemas com células vivas e in vitro.
- Facilita a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de saídas de tempo de vida de fluorescência e análise de curvas de decaimento.
- Permite comparação confiável de variantes de sondas e condições experimentais para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a visualização de RNA com modelos celulares relevantes para doenças e o desenvolvimento potencial de biomarcadores.
- Garante a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo o rastreamento quantitativo de RNA em sistemas complexos.
- Oferece uma plataforma para imagem multiplexada e expansão futura para modelos de doenças e estudos em animais vivos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O protocolo Riboglow-FLIM integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a imagem quantitativa de RNA, desde a validação in vitro até a análise em células vivas e modelos tridimensionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar a localização de RNA e a ligação de sondas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de ensaios para comparação de variantes de sondas e condições experimentais.
- Análises: Oferece medições de tempo de vida de fluorescência, curvas de decaimento e valores de amplitude para análise robusta de dados.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento com modelos de doenças e apoia o desenvolvimento de estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma de imagem padronizada e escalável, adaptável a diversos sistemas biológicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em pesquisas direcionadas ao RNA.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de imagem de RNA.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados quantitativos e reprodutíveis.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas direcionados ao RNA.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal, instrumentação FLIM e análise quantitativa de imagens.
- Exige acesso a sistemas FLIM calibrados e software compatível de aquisição de imagens.
- Necessita controle rigoroso dos parâmetros experimentais e de aquisição para garantir reprodutibilidade.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos celulares, variantes de sondas ou cenários de imagem multiplexada.
- Depende da seleção cuidadosa de regiões de interesse e do processamento de dados para obter resultados quantitativos precisos.
