Name: Produção e purificação recombinante da hidrofobina SC16 a partir de Escherichia coli e monitoramento de sua auto-montagem usando ensaios de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a produzir e purificar a hidrofobina SC16 recombinante em Escherichia coli com rendimento ≥5 mg por cultura. Este método utiliza ensaios de fluorescência com tioflavina T para monitorar a auto-montagem da proteína em interfaces ar-água.

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<table><tbody><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145224-94-8</td><td>Componente de buffer para ensaios de automontagem</td></tr><tr><td>5 mL round bottom polystyrene tube</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>Usado para ensaios de automontagem de baixo rendimento</td></tr><tr><td>96-well black polystyrene microplate</td><td>Grenier</td><td>655076</td><td>Usado para medições de fluorescência em leitor de microplacas</td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) solution (40%)</td><td>BioShop</td><td>ACR004.500</td><td>Usado para preparar géis de SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR002.1</td><td>Ágar usado para fazer placas LB resistentes a ampicilina</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02040</td><td>Antibiótico usado em placas LB-ágar</td></tr><tr><td>Baffled 2.8 L Fernbach flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td>955239</td><td>Usado para crescimento de cultura bacteriana em grande volume</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>TCI Chemicals</td><td>60-24-2</td><td>Agente redutor usado na preparação de amostras para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Column (1.5 cm diameter gravity column)</td><td>Bio-Rad</td><td>7371522</td><td>Usado para purificação por afinidade com níquel</td></tr><tr><td>Dialysis tubing (3500 kDa MWCO)</td><td>BioDesign</td><td>D302</td><td>Usado para troca de buffer durante a purificação</td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Edmund Optics</td><td>84080</td><td>Usado para ensaios de ThT (494 nm, bandpass 20 nm)</td></tr><tr><td>Excitation filter</td><td>Edmund Optics</td><td>67012</td><td>Usado para ensaios de ThT (438 nm, bandpass 24 nm)</td></tr><tr><td>Fluorescence microplate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite F200 Pro</td><td>Usado para medir a intensidade de fluorescência ThT</td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Lab Fish</td><td>HS5C</td><td>Usado para configuração de banho de água com monitoramento de temperatura</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-212</td><td>Usado para ajuste de pH dos buffers</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>TCI Chemicals</td><td>288-32-4</td><td>Usado na purificação IMAC (buffers de lavagem e eluição)</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td>Induz expressão de proteína em E. coli</td></tr><tr><td>LB broth (Lennox)</td><td>BioShop</td><td>LBL405.5</td><td>Meio de crescimento para cultura bacteriana</td></tr><tr><td>Low-speed refrigerated centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>360291</td><td>Usado para peletagem de células antes do armazenamento</td></tr><tr><td>Nickel NTA agarose beads</td><td>GoldBio</td><td>H-350-50</td><td>Resina usada para purificação por afinidade de proteínas com tag His</td></tr><tr><td>SC16 plasmid</td><td>BioBasic</td><td>N/A</td><td>Construção de DNA personalizada codificando a proteína de fusão H-GB1-SC16</td></tr><tr><td>SHuffle T7 Express competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C3029J</td><td>Cepa hospedeira usada para expressão de proteína recombinante</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>BioShop</td><td>SOD001.5</td><td>Componente de buffer e regulador de força iônica</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS255-1</td><td>Usado para ajuste de pH dos buffers</td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>BioShop</td><td>SPD579.1</td><td>Componente de buffer para manutenção do pH</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>5096</td><td>Usado para quantificação de SC16</td></tr><tr><td>Thioflavin T (ThT)</td><td>Acros Organics</td><td>2390-54-7</td><td>Corante fluorescente usado para monitorar automontagem de proteínas</td></tr><tr><td>Thrombin protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04-04-9002</td><td>Usado para clivagem da proteína de fusão H-GB1-SC16</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>BioShop</td><td>TRS001.5</td><td>Buffer usado em soluções de purificação e ensaio</td></tr><tr><td>High-speed refrigerated centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>46915</td><td>Usado para esclarecimento do lisado após lise celular</td></tr><tr><td>SDS-PAGE setup</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU</td><td>Usado para preparar e executar géis de SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

produção e purificação recombinante da hidrofobina sc16 a partir de escherichia coli e monitoramento de sua auto-montagem usando ensaios de fluorescência

Recombinant Production And Purification of Hydrophobin SC16 From Escherichia coli And Monitoring of Its Self-Assembly Using Fluorescence Assays

Produção e purificação recombinante da hidrofobina SC16 a partir de Escherichia coli e monitoramento de sua auto-montagem usando ensaios de fluorescência

Hydrophobins are small amphipathic proteins that self-assemble at hydrophobic&#8211;hydrophilic interfaces to form stable waterproof coatings over fungal ...

recombinant-production-purification-hydrophobin-sc16-from-escherichia

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

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Aprenda a produzir e purificar a hidrofobina SC16 recombinante em Escherichia coli com rendimento ≥5 mg por cultura. Este método utiliza ensaios de fluorescência com tioflavina T para monitorar a auto-montagem da proteína em interfaces ar-água.

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