Ensaio de Proteção Amikacina para Quantificação e Visualização da Invasão de Células de Escherichia coli

Focamos em caracterizar como a invasora aderente de E. coli invade as células epiteliais intestinais e identificar fatores bacterianos que contribuem para esse processo. Isolados resistentes à gentamicina limitam ensaios tradicionais de invasão. Esse protocolo baseado em amikacina permite a quantificação precisa das bactérias intracelulares.

Para começar, reúna todos os reagentes e mídias necessários para o ensaio de invasão. Em seguida, retire o estoque congelado de glicerol da cepa invasora de Escharicia colli, ou AIEC, do freezer a 80 graus Celsius. Usando uma ponta de madeira ou pipeta, raspe suavemente as bactérias do caule e espalhe-as em uma placa de parafuso Luria-Bertani, ou LB, para obter colônias individuais.

Incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, usando um bastão de madeira estéril ou ponta de pipeta, retire uma única colônia da placa do parafuso. Inocule a colônia em 3 mililitros de caldo LB e incube a cultura a 37 graus Celsius a 200 rotações por minuto durante a noite.

Depois, faça uma diluição de 1 a 10 da cultura durante a noite em 1 mililitro de LB de caldo. Meça a densidade óptica a 600 nanômetros da cultura diluída usando um espectrofotômetro. Transfira 100 microlitros da cultura noturna para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifuge a 6.000 G por 10 minutos a 4 graus Celsius.

Aspire o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet celular e re-suspenda o pellet em 1 mililitro de meio sem soro e antimicóticos antibióticos. Calcule o volume necessário de suspensão bacteriana para alcançar uma multiplicidade de infecções ou MOI de 10 usando a fórmula fornecida. Para preparar o meio de infecção, transfira o volume calculado da suspensão bacteriana para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitro e prepare o volume para 1 mililitro com meio sérico e livre de antibióticos antimicóticos.

Misture suavemente, pipetando várias vezes. Prepare uma placa de 96 poços para determinar as unidades formadoras de colônias por mililitro da cultura bacteriana diluída durante a noite, realizando diluições seriadas dez vezes em PBS estéril 1X. Transfira 200 microlitros da cultura diluída durante a noite para o primeiro poço da placa.

Pipete 20 microlitros da cultura para a próxima fileira, contendo 180 microlitros de PBS 1X. Misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes e repita o processo de diluição até atingir 10 a 6 com uma ponta nova de pipeta a cada vez. Agora repede 10 microlitros de diluições pontuais em triplicado do 10 ao 10 ao 10 até o poder de 6 diluições em chapas de parafuso LB.

Deixe as manchas serem absorvidas pela parafusa próxima à chama. Incube as placas durante a noite a 27 a 30 graus Celsius para evitar o crescimento excessivo das colônias e obter colônias individuais claras. Remova as monocamadas saudáveis de células epiteliais Caco-2 confluentes, cultivadas em uma placa de cultura de 24 poços revestida de colágeno, da incubadora e aspire o meio completo de cada poço.

Pipete um mililitro de substrato sérico e sem antibióticos em cada poço. Aspire o substrato para remover vestígios e repita a lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens. Agora adicione 1 mililitro do meio de infecção previamente preparado contendo AIEC em cada poço da placa de 24 poços contendo as células Caco-2.

Centrifuge a placa de 24 poços a 500G por 15 minutos em temperatura ambiente para sincronizar o contato bacteriano com a monocamada epitelial e incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a invasão bacteriana. Prepare um meio contendo antibióticos adicionando 240 microgramas por mililitro de amikacina a substratos pré-aquecidos e sem antibióticos. Após o período de infecção, aspire o meio das monocamadas das células Caco-2 e lave cada poço com 1 mililitro de meio sérico e livre de antibióticos antimicóticos.

Aspire o substrato e repita a lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens. Depois, pipete um mililitro de 240 microgramas por mililitro de mídia contendo amikacina em cada poço. Paralelamente, trate outro conjunto de células com 100 microgramas por mililitro de gentamicina para comparação e incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 1 hora para eliminar bactérias extracelulares.

Após a incubação, aspire o meio de cada poço. Adicione 1 mililitro de PBS para lavar as bactérias aderentes. Aspire o PBS e repita a lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens.

Agora adicione 200 microlitros de 1% Triton X100 diluído em PBS em cada poço e incube em um agitador orbital a 90 rotações por minuto por 10 minutos para lisar células epiteliais. Pipete para cima e para baixo aproximadamente 30 vezes por poço para separar as células da placa. Em seguida, realize diluições seriadas dez vezes maiores dos lisados celulares em uma placa de 96 poços usando PBS.

Placa 10 microlitros de diluições pontuais em triplicado do não diluído até 10 à potência de 3 diluições em placas de parafuso LB. Após secar as manchas, incube as placas durante a noite a 27 a 30 graus Celsius para obter colônias individuais claras. Após a incubação, remova as placas e conte as colônias bem isoladas das diluições localizais apropriadas contendo mais de sete colônias por ponto nos triplicados.

Por fim, calcule o inóculo e as unidades formadoras de colônia recuperadas por mililitro e a porcentagem de invasão usando as equações. O tratamento com gentamicina ou amikacina após a infecção das monocamadas de células Caco-2 com a cepa invasiva AIEC NRG857c, ou com a cepa controle alfa não invasiva Escherichia coli DH5 resultou em perfis de invasão semelhantes. Esses achados indicaram que a amikacina era tão eficaz quanto a gentamicina na eliminação de bactérias extracelulares e refletia com precisão a carga bacteriana intracelular.

O tratamento de isolados clínicos de Escherichia coli resistentes à gentamicina obtidos de pacientes com doença inflamatória intestinal com gentamicina resultou em valores altamente variáveis de recuperação bacteriana, variando de cerca de 21 a 2.788%. Em contraste, o tratamento com amikacina reduziu drasticamente a recuperação bacteriana em todos os isolados, demonstrando sua eficácia e permitindo medições de invasão mais confiáveis. Esse protocolo permite a quantificação precisa de bactérias intracelulares e a avaliação da invasão bacteriana em células epiteliais. Métodos adicionais, como a microscopia de imunofluorescência, podem ser usados para validar ainda mais a invasão bacteriana e validar a localização intracelular.

Estudos futuros podem identificar novos fatores de virulência e investigar vias do hospedeiro que são direcionadas durante a infecção invasiva por E. coli aderente.