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	<li>Almansour, N. M. Triple-negative breast cancer: brief review about epidemiology, risk factors, signaling pathways, treatment and role of artificial intelligence. Front Mol Biosci. 9, 836417 (2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mm plate</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>45 &micro;m filter&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLHVM33RS</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>96-well black clear bottom plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS356259</td><td>Para o Ensaio de Viabilidade Celular Luminoso CellTiter-Glo</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td>Para seleção</td></tr><tr><td>Ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo</td><td>CellTiter-Glo, Promega</td><td>G7570</td><td>Para o Ensaio de Viabilidade Celular Luminoso CellTiter-Glo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672,0050</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12 nutrient mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td></td><td></td><td>Generosidade de Robert Weinberg (MIT, Boston, EUA).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001-1G</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>LentiCas9-blast</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52962</td><td>Para geração de linha celular estável Cas9</td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52963</td><td>Backbone para clonagem gRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>MN NucleoSpin tissue kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>Para extração de DNA genômico</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>pLentiCRISPR v2&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52961</td><td>Backbone para clonagem gRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG)-8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139-500G</td><td>Para concentração de lentivírus</td></tr><tr><td>Polyethylenimine, linear (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090-1G</td><td>Para produção de lentivírus</td></tr><tr><td>Protamine sulfate (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380-25G</td><td>Para infecção por lentivírus</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 12260</td><td>Para produção de lentivírus</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td>Para seleção</td></tr><tr><td>SUM159PT adherent cells</td><td></td><td></td><td>Generosidade de Robert Weinberg (MIT, Boston, EUA).</td></tr><tr><td>Taxol</td><td>Paclitaxel, Sigma</td><td>PHR1803-200MG</td><td>Para geração e manutenção de células res</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S4202</td><td>Para seleção</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 8454</td><td>Para produção de lentivírus</td></tr></tbody></table>

exames knockout baseados em crispr-cas9 em todo o epigenoma em células quimioresistentes

Epigenome-Wide CRISPR-Cas9-Based Knockout Screens on Chemoresistant Cells

Exames knockout baseados em CRISPR-Cas9 em todo o epigenoma em células quimioresistentes

Chemotherapy resistance remains a major challenge in cancer treatment, driven by cancer cells&#39; ability to acquire adaptive properties, rewire ...

Investigamos mecanismos epigenéticos que impulsionam a resistência química no câncer de mama triplo negativo utilizando abordagens de triagem baseadas em CRISPR. Para começar, ajuste cerca de 159 PT células aderentes para 2 vezes 10 à potência de 3 células por poço em placas de 96 poços com fundo preto-transparente contendo meio Ham's F-12 Nutrient Mix, suplementado com os componentes apresentados. Incube as células por 16 horas em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, prepare uma solução estoque de Taxol dissolvida em dimetilsulfóxido ou DMSO. Para tratar as células, prepare diluições seriadas de Taxol em meio de cultura, variando de 0,3 nanomolar a 10 micromolar, e use DMSO sozinho como controle de veículo. Trate as células com 200 microlitros de doses crescentes de Taxol em triplicata.Deixe a placa em uma incubadora de cultura celular por 72 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 72 horas de tratamento com o fármaco, avalie a viabilidade celular utilizando um ensaio de quantificação de ATP baseado em luminescência. Meça a luminescência com um leitor de microplacas e normalize os resultados em relação aos valores do controle de DMSO.Em seguida, calcule os valores de concentração inibitória 10% e 50% utilizando regressão não linear com um modelo de resposta à dose logística de quatro parâmetros em um software estatístico apropriado. Para iniciar a geração de células quimiorresistentes, semeie 2 vezes 10 à potência de 5 células A549 PT por poço em placas de seis poços. E incube durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, trate as células com concentrações inibitórias de 10% ou 50% de Taxol em dois mililitros de meio de cultura por 72 horas. Se as células tolerarem a concentração atual da droga, divida-as em dois poços. Mantenha um como controle reserva com meio fresco e duplique a concentração de Taxol no outro poço.Durante a geração de células resistentes, realize a passagem das células parentais em meio contendo DMSO como controle e ajuste o volume de DMSO para corresponder à quantidade presente no respectivo tratamento com Taxol. Meça a viabilidade celular a cada três a quatro semanas até que uma diferença significativa nos valores de concentração inibitória 50% seja observada entre as linhagens celulares parentais e resistentes. Mantenha as células resistentes estáveis na concentração final de Taxol utilizada durante a escalada de dose.Para caracterização de células resistentes, realize sequenciamento de RNA, eletroforese em gel com transferência (Western blotting), qPCR e ensaios de viabilidade celular na presença da droga. Semee cerca de 159 células parentais e resistentes ao paclitaxel (PT) em triplicata em placas de 96 poços com fundo preto e transparente, na concentração de 2 × 10³ células por poço. Incube as células durante a noite a 37 °C com 5% de dióxido de carbono.Trate as células com diluições seriadas em duplicidade de verapamil, variando de 80 micromolar a 1,25 micromolar, mantendo uma concentração constante de Taxol em todas as condições de tratamento. Após 72 horas de tratamento, avalie a viabilidade celular utilizando um ensaio de quantificação de ATP baseado em luminescência. Determine a concentração de verapamil que mantém a viabilidade celular enquanto restaura a sensibilidade em células resistentes.Para determinar a concentração de puromicina a ser usada em combinação com verapamil, semeie cerca de 159 células PT resistentes ao Taxol em uma placa de 96 poços a 2 × 10³ células por poço. Incube a placa por 16 horas a 37 °C e 5% de dióxido de carbono. Prepare diluições seriadas em duplicata de puromicina, variando de 40 a 0,625 microgramas por mililitro, em meio contendo a concentração previamente determinada de verapamil.Trate as células com as diluições de puromicina conforme indicado por 72 horas. Após o ensaio de viabilidade, identifique a menor concentração de puromicina que reduz a viabilidade para 5% ou menos na presença de verapamil. Em seguida, utilize algumas células resistentes ao PT Taxol 159 para calcular a titulação viral e a multiplicidade de infecção.Adicione o volume calculado de lentivírus Cas9, com base na multiplicidade de infecção desejada, diretamente às células no meio de cultura contendo oito microgramas por mililitro de sulfato de protamina. Substitua o meio viral por meio fresco 16 horas após a infecção. No dia seguinte, aplique a seleção com blasticidina substituindo o meio de cultura por meio contendo a concentração previamente determinada de blasticidina.Continue a seleção até que as células não infectadas sejam eliminadas. Valide a atividade da Cas9 com RNAs guia únicos de controle para genes essenciais ou use GFP como repórter para avaliar a eficiência de interrupção gênica. Calcule o número de células infectadas com sucesso necessárias para atingir a cobertura desejada da biblioteca utilizando a equação apresentada.Prepare misturas de infecção independentes para cada replicata biológica. Após semear as células previamente calculadas, infecte-as com um volume viral determinado em oito mililitros de meio de cultura completo contendo oito microgramas por mililitro de sulfato de protamina. Após 16 horas, substitua o meio viral por meio fresco e incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Realize a seleção com puromicina na presença de verapamil nas concentrações previamente determinadas para enriquecer as células infectadas com sg-RNA em cerca de 159 células PT resistentes ao Taxol. Continue a seleção até que todas as células na placa controle não infectada sejam eliminadas. Normalmente, por aproximadamente três dias.Após a conclusão da seleção com puromicina e verapamila, faça a tripsinização das células e colete um ponto de tempo inicial, o pellet de células no tempo zero, de cada replicata biológica correspondente ao nível de cobertura decidido durante a transdução. Divida as células em braços experimentais, mantendo a cobertura. Um braço como controle com DMSO.E o outro como tratamento com Taxol. Mantenha as culturas por 14 a 16 duplicações populacionais. Calcule o nível de duplicação populacional utilizando a fórmula especificada.Em cada passagem, monitore a viabilidade celular e a cinética de crescimento. Mantenha números celulares adequados para evitar gargalos. Ao atingir o nível desejado de duplicação populacional, colete os pellets do ponto final de tempo para cada replicata e condição, mantendo a cobertura da biblioteca por pellet.Armazene os pellets a 80 graus Celsius até a extração subsequente de DNA genômico. As células resistentes continuaram a proliferar, apesar do tratamento com Taxol, enquanto as células parentais não sobreviveram sob o mesmo tratamento. O sequenciamento de RNA identificou ABCB1 como um dos genes mais superexpressos nas células resistentes, seguido por outros transportadores ABC, incluindo ABCB4 e ABCA5.A superexpressão da expressão de ABCB1 em células resistentes foi validada por PCR quantitativa. Células resistentes ao Taxol apresentaram fenótipo de resistência múltipla a fármacos e resistência à doxorrubicina e à vincristina. A seleção com puromicina pode não ser eficiente em células resistentes porque a puromicina pode ser expulsa por meio da efluxo de fármacos mediado por ABCB1.Sozinho, o verapamil não afetou a viabilidade celular. No entanto, quando combinado com agentes quimioterápicos, o verapamil restaurou a sensibilidade a esses agentes. Doses não tóxicas de verapamil também restauraram a sensibilidade à puromicina em células resistentes ao Taxol.Quando amostras do ponto temporal final de condições tratadas com DMSO ou Taxol foram comparadas com o ponto temporal inicial, quase todos os genes essenciais foram esgotados após o knockout, confirmando a qualidade da triagem. Em contraste, a comparação entre amostras terminais tratadas com DMSO e com Taxol não mostrou esgotamento de genes essenciais, já que esses genes permanecem essenciais em ambos os grupos. Em vez disso, essa comparação revela modificadores epigenéticos que sensibilizam ao Taxol.Vários genes de controle positivo e modificadores epigenéticos foram significativamente esgotados na tela EPIKOL realizada em células resistentes ao Taxol. Os RNAs guia únicos direcionados ao ABCB1 foram especificamente esgotados no grupo tratado com Taxol, confirmando o ABCB1 como um controle positivo para a sensibilidade ao Taxol na tela. Este protocolo permite aos pesquisadores estudar a resistência à terapia em modelos de câncer e identificar reguladores epigenéticos da resistência à quimioterapia utilizando plataformas de triagem CRISPR.A consideração mais importante ao triar células quimiorresistentes é manter a representação da biblioteca e otimizar as condições de transdução e seleção. O trabalho futuro identificará vulnerabilidades terapêuticas de células cancerígenas resistentes a múltiplas drogas e desenvolverá novas abordagens combinatórias para superar a quimiorresistência.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Apresentamos uma nova abordagem para caracterizar as células do tumor. Nós combinamos a imunofluorescência com DNA fluorescentein situ-hibridação para avaliar células capturadas por um fio médico funcionalizado capaz de na vivo enriquecimento CTC diretamente do sangue do paciente.

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

Atualmente, coloração imunofluorescente sobre células fixas é o método de escolha para determinação dos níveis de expressão de proteínas quando informações morfológicas também são necessárias. Este protocolo apresentado neste documento prevê-se um método alternativo de imunocitoquímica em blocos de parafina.

Determinação do nível de expressão da proteína em pilhas cultivadas por imunocitoquímica em blocos de parafina

Para expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com câncer de pulmão para tratamento com pembrolizumab, de forma confiável e reproduzível, nós desenvolvemos um ensaio que usa o concentrado de 22 3 anticorpo em um amplamente disponível imuno-histoquímica autostainer, para amostras tanto biópsia e citologia.

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Uma placa de imagem baseada em HMCA é apresentada para o desempenho do ensaio de invasão. Este prato facilita a formação de esferoides tridimensional (3D) tumor e a medição da invasão de células de câncer na matriz extracelular (ECM). A quantificação de ensaio de invasão é conseguida análise semiautomático.

Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

Este manuscrito descreve um método de CRISPR-Cas9-baseado em cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repete (CRISPR) para investigação célere e simples do papel dos vários genes candidatos na proliferação de células de leucemia mieloide aguda (LMA) em paralelo. Esta técnica é escalável e pode ser aplicada em outras linhas de células de câncer também.

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Aqui, apresentamos um ensaio de cocultura fácil de usar para analisar a migração de glioblastoma (GBM) em neurônios padronizados. Desenvolvemos uma macro no software FiJi para fácil quantificação da migração celular GBM em neurônios, e observamos que os neurônios modificam a capacidade invasiva celular GBM.

Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Aqui demonstramos um método para aplicar o estresse da tesoura de fluido às células cancerosas em suspensão para modelar os efeitos do estresse hemodinâmico nas células tumorais circulantes.

Modelando os efeitos do estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando uma seringa e agulha

Este protocolo descreve o isolamento de timócitos duplo-negativos do timo de camundongo seguido de transdução retroviral e co-cultura no sistema de co-cultura de linhagem celular estromal de medula óssea delta-like 4 (OP9-DL4) para análise funcional adicional.

Co-cultura e transdução de timócitos murinos em células estromais delta-like 4 expressando para estudo de oncogenes em leucemia de células T

Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. O modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal e permite a avaliação de novas drogas terapêuticas em um cenário clinicamente relevante de metástases pulmonares e hepáticas.

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Koç University School of Medicine.  Aqui, apresentamos um protocolo para gerar células quimioresistentes usando uma abordagem de escalonamento de dose, seguido por uma triagem baseada em CRISPR/Cas9 usando uma biblioteca focada de sgRNA direcionada a modificadores epigenéticos para identificar reguladores da quimiorresistência adquirida. O protocolo também oferece múltiplos pontos de otimização adaptados a modelos celulares quimioresistentes, oferecendo uma estrutura...

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