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<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtubes Axygen</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate Falcon polystyrene microplate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid, 60%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 30%&nbsp; and bis-acrylamide solution, 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610157</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum fold</td><td>Reynolds&nbsp;</td><td>U07211R0</td><td></td></tr><tr><td>Amonium Persulfate (APS)</td><td>Merck</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Binocular stereomicroscope</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>&nbsp;A9418</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DelltaVision microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H2O</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 &mu;m pore</td><td>Thermo Fisher Scientific/Nalgene</td><td>09-740-63B</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps FST Dumont SS</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed&nbsp; anti-rat labelled by AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11073</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Merck</td><td>Z412392</td><td></td></tr><tr><td>Growing chambers / greenhouse / or field</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Merck</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Masking tape 3M</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-047-259</td><td></td></tr><tr><td>Maize seeds</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 22 x 22 mm-H coverslips&nbsp;</td><td>Deckgl&auml;ser, Zeiss</td><td>474030-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide box</td><td>Fisher Scientific,</td><td>03-448-9</td><td></td></tr><tr><td>Micropipets P20, P200, P1000</td><td>Merck</td><td>CLS4069</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td>Merck</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Grade</td><td>&nbsp;15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic box with lid</td><td>Tupperware</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Antifading</td><td>Molecular Probes</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish regular size</td><td>Merck</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Merck</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (0.5-10 uL) sterile&nbsp;</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT300</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (200 uL) sterile</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT200Y&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (1000 uL) sterile</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT1000BRS</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade - single edged</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform shaker</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Merck</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Merck</td><td>S8143</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure Acrylamide</td><td>Invitrogen</td><td>15512023</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imunolocalização tridimensional em meiocitos de milho

Three-Dimensional Immunolocalization In Maize Meiocytes

Imunolocalização Tridimensional em Meiocitos de Milho

During meiotic prophase I, the physical configuration of chromosomes varies widely across developmental stages, fortunately these stage-specific ...

Nossa pesquisa concentra-se no desenvolvimento de uma abordagem tridimensional para estudar meiócitos masculinos de milho e visualizar proteínas meióticas em células individuais. Além do milho, este protocolo pode ser aplicado para estudar meiócitos em arroz, centeio, cevada e trigo. Para começar, obtenha plantas de milho no estágio V13 com inflorescências ainda em crescimento dentro do caule.Durante a semana da fixação de anteras mióticas, pressione suavemente o entrenó aumentado na saliência, usando luvas, para verificar se está macio o suficiente para ser cortado. Após preparar os tampões necessários, prepare uma câmara úmida colocando de cinco a dez toalhas de papel umedecidas dentro de uma caixa de plástico. Remova o excesso de água da câmara.Usando uma lâmina de barbear, corte o caule ao nível da inflorescência para expor os ramos da espiga e os ramos laterais. Após dissecar e coletar os ramos laterais, envolva-os em toalhas de câmara úmida, mantendo a câmara em temperatura ambiente. Usando um microscópio estereoscópico, colete anteras frescas das flores em uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de tampão X A 1X ou BA. Identifique as fases meióticas com base no tamanho e na cor.Após transferir as anteras para um novo recipiente de Petri de 35 milímetros, adicione três mililitros de solução fixadora às anteras. Sobreponha o recipiente de Petri com parafilm para evitar a evaporação do formaldeído. Coloque o recipiente de Petri de 35 milímetros sobre o recipiente de Petri maior posicionado em um agitador rotativo, ajustado para 40 a 60 RPM à temperatura ambiente durante 45 minutos.Lave as anteras com três mililitros de XBA 1X. Após transferir as anteras para uma pequena placa de Petri, feche a placa e coloque-a em um agitador rotativo à temperatura ambiente por 45 minutos, com a velocidade ajustada entre 40 e 60 rpm. Usando pinças limpas, transfira as anteras para uma pequena placa de Petri de 35 milímetros contendo três mililitros de XBA 1X.Uma vez que a placa de Petri esteja bem vedada com parafina, coloque a placa menor dentro de uma placa maior. Após cobri-la com papel alumínio, armazene a amostra a quatro graus Celsius até o uso. No primeiro dia, prepare dois mililitros de solução de acrilamida misturando volumes iguais de acrilamida e dois XBA.Desgase a solução de acrilamida sob vácuo por cinco a 10 minutos antes de adicionar sulfito de sódio e persulfato de amônio. Aliquote 100 microlitros de uma mistura um para um de acrilamida e dois XBA em tubos de 1,5 mililitro de acordo com o número de lâminas preparadas. Coloque pedaços de parafina de dois centímetros por dois centímetros sobre uma placa de Petri e posicione-os sob um estereoscópio de dissecção.Após cortar a ponta da pipeta usando tesoura, pipete 50 microlitros de solução de BA com anteras sobre o parafilm. Pipete 25 microlitros de solução de BA em outra região do parafilm. Após segurar as anteras com pinça, use um bisturi para cortar suas pontas.Uma vez que os meiócitos sejam espremidos, use uma pipeta para transferi-los para a gota de 25 microlitros de BA e misture suavemente. Pipete 10 microlitros da mistura de meiócitos sobre uma lamínula separada. Adicione rapidamente cinco microlitros de sulfito de sódio e cinco microlitros de perossulfato de amônio em um tubo de 1,5 mililitro contendo acrilamida e dois XBA.Pipete cinco microlitros dessa mistura sobre a lamínula e misture-a com os meiócitos. Coloque uma lamínula revestida com poli-lisina por cima, em um ângulo de 45 graus. Após permitir de 30 a 50 minutos para polimerização completa à temperatura ambiente, separe cuidadosamente as lamínulas usando uma lâmina de barbear.Em seguida, posicione-os com a face do adesivo voltada para cima em uma placa de Petri. Lave a lamínula com um mililitro de PBS 1X suplementado com um milimolar de ácido etilenodiaminotetraacético, ou EDTA, e 1% de Triton, à temperatura ambiente, durante duas horas. Prepare e combine anticorpos primários de espécies hospedeiras diferentes para garantir sinais distintos durante a detecção.Adicione 50 microlitros do anticorpo primário diluído ao centro da lamínula contendo a almofada. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma câmara úmida durante a noite. No segundo dia, prepare 500 mililitros de solução de lavagem contendo um XPBS, 0,1% de Tween 20 e um milimolar de EDTA.Utilizando uma pipeta, remova a solução da noite anterior. Lave a lamínula duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem. Após a remoção do tampão, adicione novamente um mililitro de tampão de lavagem e incube por uma hora à temperatura ambiente.Repita este passo de lavagem mais sete vezes. Após a lavagem final, cubra a placa e deixe-a durante a noite em uma câmara úmida. Prepare os anticorpos secundários diluindo-os na proporção de um para 50 em tampão bloqueador.Após remover a solução de lavagem, adicione 50 microlitros do anticorpo secundário diluído ao centro de cada disco. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma câmara úmida por duas horas à temperatura ambiente. Após remover a solução do poço, lave quatro vezes com um mililitro de tampão de lavagem durante uma hora cada lavagem à temperatura ambiente.Lave o poço com um mililitro de PBS durante 10 minutos e repita este processo mais duas vezes. Adicione 500 microlitros de DAPI, preparado numa concentração final de um micrograma por mililitro, ao poço e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após remover o prolongador dourado de quatro graus Celsius, deixe-o descongelar até atingir a temperatura ambiente.Lave as lâminas com um mililitro de PBS durante 30 minutos e repita duas vezes. Após remover a solução final de lavagem, adicione duas gotas de antifade prolongado no centro do suporte. Assim que a lamínula for levantada do poço, monte-a sobre as lâminas identificadas.Usando vácuo, remova o excesso de glicerol das bordas da lamínula e selar com duas camadas de esmalte de unha. Observe as lâminas ao microscópio utilizando comprimentos de onda de excitação apropriados e filtros para capturar imagens. A coloração com DAPI mostrou um núcleo bem definido e coloração da cromatina, juntamente com coloração citoplasmática nativa mais fraca do DNA de plastídeos e mitocôndrias.Ausência de Absence of first division one ou AFD1, asynaptic one ou ASY1 e Zipper1 ou ZYP1 localizadas nos cromossomos e no citoplasma durante a pré-leptótena. Em estágios posteriores, o sinal concentrou-se no cromossomo, enquanto uma quantidade considerável de ZYP1 permaneceu no citoplasma antes da sinapse completa. A coesina meiótica AFD1 formou uma estrutura linear somente após a zigótena.Concomitantemente com a formação de filamentos lineares do complexo sinaptonêmico. O sinal de ASY1 tornou-se comparativamente fraco após a incorporação de ZYP1 e AFD1 nas estruturas lineares. Este protocolo permite aos pesquisadores estudar a co-localização e dinâmica de proteínas, a localização subcelular nativa, a arquitetura cromossômica tridimensional, a progressão meiótica e o estadiamento.O principal desafio neste protocolo é selecionar cuidadosamente combinações compatíveis de anticorpos primários e secundários. Os estudos podem se basear neste trabalho comparando a meiose de machos e fêmeas para investigar o mecanismo molecular subjacente à athelchasmi.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este protocolo apresenta como viver a imagem e analisar os meristemas apical de tiro de diferentes espécies de plantas usando laser, microscopia confocal.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Os primórdios das folhas de milho são profundamente embainhados e enrolados, tornando-os difíceis de estudar. Aqui, apresentamos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais.

Métodos aprimorados para preparar seções transversais e montagens inteiras não enroladas de primordia de folhas de milho para fluorescência e imagens confocais

Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.

Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho

O movimento cromossômico durante a prófase meiótica é um fenômeno pouco compreendido que é fundamental para a formação de esporos. Este protocolo descreve um método para adquirir, analisar e quantificar os movimentos do centrômero durante a prófase meiótica em meiócitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Caracterização por imagem ao vivo dos movimentos do centrômero durante a prófase meiótica masculina em Arabidopsis thaliana

255 visualizações.  National Autonomous University of Mexico (UNAM). Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de uma abordagem 3D para estudar meiócitos masculinos do milho e visualizar proteínas meóticas em células únicas. Além do milho, esse protocolo pode ser aplicado para estudar meiócitos em arroz, centeio, cevada, trigo. Para começar, obtenha plantas de milho na fase V13 com inflorescências ainda crescendo dentro do caule.Durante a semana da fixação de anteras mióticas, pressione suavemente o caule inchado na protuberância enqua...

Imunolocalização Tridimensional em Meiocitos de Milho

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