Name: Reconstituindo a Montagem de Actina Ramificada Mediada por Miosina-I em um Ensaio de Motilidade de Caudas de Cometa de Actina Baseado em Esferas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a reconstituir a montagem de actina ramificada mediada por miosina-I em ensaios de motilidade de caudas de cometa. Este método permite analisar quantitativamente a dinâmica do citoesqueleto e a geração de força em interfaces semelhantes a membranas.

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Agradecemos ao Dr. Daniel Safer e a Rick Wike pela excelente assistência técnica na purificação de proteínas. Agradecemos ao Dr. Roberto Dominguez, especialmente às Dras. Malgorzata Boczkowska e Grzegorz Rebowski, por generosamente fornecerem o complexo Arp2/3 e as proteínas CapZ. Também agradecemos ao Dr. Luther Pollard, à Dra. Faviolla A. Báez-Cruz e a todos os membros dos laboratórios Ostap e Dominguez pelo valioso contributo ao longo do projeto. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa dos National Institutes of Health R37 GM057247 (para E.M.O.). E.M.O. e M.X. foram parcialmente apoiados pela National Science Foundation (CMMI-1548571). O ChatGPT foi utilizado para auxiliar na edição linguística durante a revisão do manuscrito. Os autores revisaram e editaram todo o conteúdo assistido por IA e assumem total responsabilidade pelo manuscrito final.

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Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes nem conflitos de interesse.

O ensaio de motilidade de bastões com cauda de actina em formato de cometa é um sistema bem estabelecido de reconstituição in vitro para investigar a montagem ramificada de actina mediada pelo complexo Arp2/3 e seu papel na geração de forças protrusivas14,15,16,17. Esse sistema tem sido amplamente aplicado para analisar a regulação bioquímica da montagem de actina ramificada14,15,26,27,31,49,50,51 e a geração de força20,21,22,23,52, além de fornecer uma estrutura para estudos quantitativos das propriedades emergentes da matéria ativa em redes de actina19,35,36,53. Ao incorporar miosina, particularmente a miosina-I18, nesse sistema reconstituído, o ensaio modificado permite investigar como o acoplamento entre miosina e actina modula a montagem de actina e a produção de força na interface da membrana, uma área ainda relativamente pouco explorada. Notavelmente, a miosina-I nesse sistema pode ser facilmente substituída por outros motores de miosina para examinar seus respectivos papéis na remodelação da rede de actina e na geração de força. Por exemplo, miosina V (transporte de carga)54, miosina VI (tráfego endocítico e dinâmica da membrana)55,56, miosina VII e XV (organização de estereocílios e microvilosidades)57,58,59, miosina X (formação de filopódios)60,61 e miosina XIX (dinâmica mitocondrial)62 poderiam ser incorporadas para investigar como diferentes classes de miosina contribuem para a organização da actina e seus processos fisiológicos associados.
O ensaio é altamente reprodutível desde que diversos parâmetros críticos sejam cuidadosamente controlados. Primeiro, a presença de G-actina monomérica de alta qualidade é essencial para a formação robusta de caudas em cometa. Recomendamos purificar a G-actina a partir de pó de acetona de músculo esquelético de coelho utilizando protocolos estabelecidos41. Após 2–3 dias de diálise, a actina monomérica deve ser ainda mais purificada por filtração em gel em Sephacryl S-300 em tampão G (2 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,2 mM ATP; 0,1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; e 0,5 mM DTT). Devem ser utilizadas as frações coletadas imediatamente após o pico de eluição. A G-actina purificada geralmente mantém forte atividade de polimerização por 2–3 semanas quando armazenada em gelo a 4 °C e pode permanecer utilizável até a quarta semana, embora o desempenho geralmente diminua após esse período. A redução na robustez das caudas em cometa, caracterizada por redes de actina escassas e frágeis e crescimento inconsistente das caudas, frequentemente indica qualidade comprometida da actina. Segundo, a atividade das proteínas nucleadoras (NPF) determina criticamente a formação das caudas em cometa. O domínio GST-VCA (WCA) etiquetado com GST proveniente da proteína de síndrome de Wiskott-Aldrich neuronal humana (N-WASP) comercial fornece atividade de nucleação robusta e sustentada, e a dimerização do GST potencializa ainda mais essa atividade63. Recomendamos validar qualquer construto de NPF utilizando um ensaio de polimerização de actina com pirênio antes do revestimento das microesferas. A atividade do GST-VCA comercial pode servir como padrão de referência. Notavelmente, o GST-VCA comercial utilizado aqui não possui uma região poliprolina e, portanto, não interage com complexos de profilina-actina26. Terceiro, a visualização confiável do crescimento das caudas em cometa exige preparação cuidadosa das lâminas e lamínulas. Recomendamos limpar minuciosamente lâminas e lamínulas com água e etanol, seguido de limpeza com plasma imediatamente antes do uso. Quando disponíveis, lamínulas silanizadas com polietilenoglicol26 são preferíveis, pois minimizam a adsorção proteica não específica e melhoram a reprodutibilidade. Incluir uma concentração adequada de BSA na mistura de motilidade pode ainda mais reduzir interações superficiais não específicas e promover desempenho consistente do ensaio. Quarto, o volume da amostra aplicada à câmara é crítico para medições confiáveis15,16,17. Um volume excessivo de amostra resulta em microesferas que se deslocam, impedindo o rastreamento preciso do alongamento da cauda em cometa. Em contraste, um volume insuficiente de amostra comprime as microesferas entre a lâmina e a lamínula, aumentando o atrito e imobilizando-as. Essa restrição mecânica pode distorcer a morfologia da cauda em cometa e alterar a cinética de crescimento medida. Portanto, otimizar tanto a altura da câmara quanto o volume da amostra é essencial para resultados reprodutíveis. Recomendamos otimizar empiricamente o volume da amostra para cada configuração experimental. Ao utilizar uma lamínula de 22 mm × 22 mm conforme descrito aqui, a aplicação de 2,1–2,3 µL da mistura de motilidade produz uma altura de câmara de aproximadamente 4,3 µm, resultando em posicionamento estável de microesferas com diâmetro de 2,0 µm, sem deslocamento excessivo ou compressão.&#160;Quando uma lamínula de tamanho diferente for utilizada, o volume da amostra deve ser ajustado adequadamente para garantir preenchimento uniforme da câmara, posicionamento estável das microesferas e deslocamento mínimo da amostra.
Se as caudas de cometa não se formarem, verifique a competência da polimerização da actina e a atividade dos NPF. Se a quebra de simetria não ocorrer, ajuste a concentração de CP para modular a densidade da rede. Redes excessivamente densas resistem à fratura, enquanto redes muito esparsas carecem de integridade estrutural. Se as microesferas revestidas com miosina não mostrarem diferença em relação às microesferas controle, confirme a densidade superficial da miosina e a atividade do motor. Para controle de qualidade, o critério de aceitação é funcional, e não baseado em um valor numérico absoluto. Um novo preparo é considerado aceitável se,&#160;reproduzir a formação e o crescimento das caudas de cometa observados com um preparo previamente validado (conforme mostrado na&#160;Figura 3). Além disso, cada novo preparo de miosina, complexo Arp2/3, NPF, CapZ ou actina deve ser avaliado utilizando os ensaios apropriados de controle de qualidade e comparado com um preparo previamente validado antes do uso, para garantir consistência entre experimentos quantitativos (ver Seção do Protocolo 3.1).
Várias limitações deste ensaio devem ser consideradas ao interpretar os resultados. Primeiramente, a intensidade de fluorescência é utilizada como uma medida relativa e não calibrada da densidade da rede de actina; portanto, comparações devem ser feitas apenas entre amostras imagiadas sob condições idênticas de aquisição e analisadas utilizando o mesmo protocolo de limiarização. Em segundo lugar, a motilidade das microesferas, o crescimento da cauda em cometa e a eficiência de crescimento fornecem leituras indiretas do comportamento da rede geradora de força, mas não constituem medições diretas de força. Medições mecânicas diretas, como o aprisionamento óptico ou ensaios de deformação de membrana com calibração de força64,65, são necessárias para quantificar as forças produzidas pela rede. Em terceiro lugar, este ensaio não resolve diretamente a ultraestrutura da rede de actina, por exemplo, a orientação dos filamentos, a densidade de ramificações ou a organização local da miosina.&#160;Abordagens complementares, como microscopia eletrônica ou imagens de super-resolução, podem ser necessárias para a caracterização da estrutura em escala nanométrica&#160;. Por fim, o uso de microesferas rígidas de tamanho micrométrico fornece uma interface simplificada e experimentalmente viável, mas não reproduz a deformabilidade, a heterogeneidade de curvatura, a mobilidade lipídica ou a complexidade molecular das membranas celulares. Assim, o desenvolvimento futuro de interfaces mais fisiologicamente relevantes será importante para investigar como os componentes do citoesqueleto se coordenam na borda anterior da célula.
No geral, essa abordagem de reconstituição oferece controle preciso sobre a composição e concentração proteica, permitindo que componentes individuais sejam analisados mecanisticamente de maneiras difíceis de alcançar em sistemas celulares. Ela fornece uma plataforma versátil para estudar como motores moleculares remodelam redes de actina ramificadas e moldam a geração de força em interfaces semelhantes a membranas. Com validação apropriada, o ensaio pode ser estendido para examinar como diferentes classes de miosina, variantes mutantes ou associadas a doenças e proteínas ligadoras de actina sensíveis à força regulam o feedback mecânico dentro de redes de actina dinâmicas. De forma mais ampla, este sistema ajuda a conectar a atividade do motor em escala molecular à organização citoesquelética em escala mesoscópica e à função mecânica, com implicações para a motilidade celular, endocitose e remodelação de membranas.

A polimerização de actina ramificada mediada pelo complexo de proteína relacionada à actina 2/3 (Arp2/3) gera as forças protusivas principais que impulsionam diversos processos celulares, incluindo motilidade celular, endocitose, fagocitose e a formação de complexos de adesão celular1,2,3,4,5,6. Na borda anterior de células migratórias, fatores que promovem a nucleação (FPNs) ativam o complexo Arp2/3 na membrana plasmática, iniciando a montagem de uma rede dendrítica de actina que empurra a membrana para frente. Motores de miosina-I frequentemente colocalizam-se com essas redes de actina ramificada em interfaces de membrana e estão implicados na regulação&#160;da organização da actina&#160;e na modulação da geração de força7,8,9,10,11,12,13. Apesar das evidências crescentes de que a miosina-I contribui para processos mecânicos dependentes de actina, os mecanismos moleculares pelos quais a miosina-I interage com a montagem de actina ramificada mediada pelo Arp2/3 para modular a arquitetura da rede e a produção mecânica permanecem pouco compreendidos.
Para preencher essa lacuna, incorporamos a miosina-I ao bem estabelecido sistema de motilidade de bastões com cauda de cometa de actina14,15,16,17 para reconstituir a interação entre miosina-I, actina e o complexo Arp2/3 na superfície de bastões com dimensões micrométricas. O objetivo geral deste método é investigar quantitativamente como o acoplamento miosina-actina influencia a montagem de actina ramificada, a arquitetura da rede, a quebra de simetria e a motilidade dos bastões em uma interface semelhante à membrana. Neste ensaio, miosina-I e fatores de nucleação (NPFs) são revestidos conjuntamente sobre bastões em escala micrométrica para imitar sua colocalização na membrana plasmática18. Após a iniciação da polimerização, os NPFs ligados à superfície estimulam a montagem ramificada de actina dependente de Arp2/3, levando à formação de uma camada de actina, à quebra de simetria e ao desenvolvimento de uma cauda de cometa polarizada&#160;que impulsiona a propulsão do bastão14,19,20,21,22,23. Ao variar sistematicamente a densidade superficial da miosina18 e modular a densidade da rede de actina por meio da concentração da proteína tampão (CP)15,19,24, este método permite a análise quantitativa da cinética de montagem da actina, eficiência de crescimento, arquitetura da rede e motilidade dos bastões, fornecendo leituras indiretas relacionadas às alterações dependentes da miosina-I na produção mecânica.
O ensaio também oferece vantagens distintas em comparação com abordagens complementares. Em contraste com ensaios de polimerização em massa, como os ensaios com pirreno-actina, este sistema de motilidade de microesferas permite a visualização direta da montagem de actina ramificada e do movimento de microesferas impulsionado pela polimerização de actina. Em oposição a estudos celulares, nos quais funções proteicas sobrepostas e ambientes celulares complexos podem obscurecer contribuições individuais e complicar a interpretação, este ensaio proporciona controle preciso sobre a composição, concentração e organização superficial das proteínas, permitindo assim a investigação sistemática de como a miosina-I interage com a montagem de actina mediada pelo Arp2/3 em condições bioquímicas definidas.
Este método é mais apropriado para estudar como os componentes do citoesqueleto se coordenam em uma interface semelhante à membrana&#160;para regular a arquitetura da rede de actina e a produção mecânica. Embora o protocolo atual esteja otimizado para a montagem de actina ramificada mediada por miosina-I, seu design modular pode ser adaptado no futuro para examinar outras classes de miosinas associadas à membrana (por exemplo, miosina VI, VII, X, XV e XIX) e/ou proteínas ligadoras de actina (por exemplo, forminas, proteína fosforilada estimulada por vasodilatador (VASP), cortactina, coronina ou tropomiosina). Tais adaptações exigiriam a validação da imobilização, atividade e densidade superficial das proteínas. Além disso, o ensaio é compatível com estratégias de marcação por pulso e chased. A incorporação de actina fotoconvertível ou fotoativável, ou subunidades Arp2/3 marcadas, poderia permitir a medição das taxas de renovação de filamentos e dissociação de ramificações dentro da rede em crescimento25. De modo geral, este ensaio fornece uma plataforma versátil para examinar a interação molecular entre motores associados à membrana, filamentos de actina e proteínas ligadoras de actina, bem como para investigar como motores e proteínas ligadoras de actina regulam a remodelação da rede e a geração de força em interfaces semelhantes à membrana14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. De forma mais ampla, também serve como uma plataforma mínima e ajustável de matéria ativa para investigar os princípios físicos subjacentes à dinâmica fora do equilíbrio impulsionada por motores, como quebra de simetria, auto-organização, retroalimentação mecanoquímica e outros comportamentos emergentes em redes ativas de actomiosina18,19,20,21,22,23,35,36, com possível relevância para a física da matéria ativa e a engenharia de materiais.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&amp;prime;-trifosfato dissódica sal hidratada</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>Utilizada para preparar tampões contendo ATP; alíquotas e armazenar a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Complexo Arp2/3</td><td>Preparado internamente</td><td>N/A</td><td>Utilizado para nucleação de redes de actina ramificadas; purificado conforme referência 42.</td></tr><tr><td>Corante fluorescente Biotina-CF640</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Utilizado para marcar fluorescentemente as esferas controle; proteger da luz e armazenar a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mio1d biotinilada</td><td>Preparado internamente</td><td>N/A</td><td>Proteína motora utilizada para revestir esferas recobertas com miosina; preparada conforme descrito nas referências 18 e 38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Utilizada para bloqueio de esferas e tampões de armazenamento; preparar uma solução estoque filtrada.</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Componente do tampão utilizado no tampão X e em experimentos de interrupção por cálcio.</td></tr><tr><td>Calmodulina</td><td>Preparado internamente</td><td>N/A</td><td>Adicionada às reações contendo miosina e ao tampão de armazenamento de esferas; purificada conforme referência 44.</td></tr><tr><td>Esferas de poliestireno carboxilado (diâmetro de 2,0 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>Utilizadas como suporte sólido para revestimento com FPN, NeutrAvidina, corante fluorescente e miosina; armazenar a 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Utilizada para aquisição de imagens de fluorescência durante a microscopia com lapso de tempo.</td></tr><tr><td>Corante Coomassie Brilliant Blue</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Utilizado para colorir géis de SDS-PAGE antes da análise densitométrica.</td></tr><tr><td>Cobreglass, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1.5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>Utilizado com lâminas de microscópio para montar câmaras de compressão.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Agente redutor utilizado em tampões e misturas de motilidade; armazenar a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo seca tipo scroll</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Utilizada para operar o sistema de limpeza a plasma.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Quelante de cálcio utilizado no tampão M, tampão de motilidade e pré-tratamento da actina.</td></tr><tr><td>Fonte de luz externa</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Fonte de luz de haleto metálico para microscopia de fluorescência.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Open source</td><td>N/A</td><td>Utilizado para análise de comprimento de caudas de cometa, intensidade de fluorescência e densidade de rede (versão 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Microscópio invertido de epifluorescência utilizado para imagens de caudas de cometa de actina.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>Componente da solução de descoloração de géis de SDS-PAGE; corrosivo, manusear com as precauções apropriadas.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>Fator de promoção de nucleação utilizado para montagem de actina mediada por Arp2/3; alíquotas e armazenar a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Reagente tamponante utilizado no tampão X, tampão M e tampão de motilidade.</td></tr><tr><td>CapZ humano</td><td>Preparado internamente</td><td>N/A</td><td>Proteína tampão utilizada para regular a densidade da rede de actina; purificada conforme referência 43.</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Componente do tampão utilizado em tampões de reação e pré-tratamento da actina.</td></tr><tr><td>Software de imagem MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Utilizado para controle do microscópio e aquisição de imagens (versão 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>Componente da solução de descoloração de géis de SDS-PAGE; inflamável, manusear conforme os procedimentos de segurança institucionais.</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Adicionada ao tampão de motilidade para aumentar a viscosidade da solução (1500 cP).</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Utilizadas para montar câmaras de compressão para microscopia.</td></tr><tr><td>Proteína NeutrAvidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Utilizada para imobilização de proteínas biotiniladas nas superfícies das esferas; alíquotas e armazenar a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Escada de proteínas pré-coloridas PageRuler Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>Marca-dor de peso molecular utilizado para análise de SDS-PAGE; armazenar a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Limpeza a plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Utilizada para limpeza a plasma de lâminas e cobreglass antes da montagem da câmara.</td></tr><tr><td>Filtro de seringa de poliéter sulfona, 0,22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Utilizado para filtrar a solução estoque de albumina sérica bovina antes da alíquota.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Sal utilizado para manter a força iônica em tampões de ensaio.</td></tr><tr><td>Actina de músculo esquelético de coelho</td><td>Preparado internamente</td><td>N/A</td><td>Purificada conforme referência 41 e utilizada como G-actina em ensaios de montagem de caudas de cometa de actina.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Utilizada para sedimentação de esferas durante a preparação e etapas de lavagem.</td></tr><tr><td>Misturador rotativo (rotador de bancada)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Utilizado durante incubações de revestimento de esferas para manter a suspensão.</td></tr><tr><td>Tampão de corrida Tris/Glicina/SDS (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>Diluir para 1&amp;times; antes da eletroforese em SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Graxa de vácuo</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>Utilizada para selar câmaras de compressão antes da imagem de fluorescência.</td></tr><tr><td>Gel de poliacrilamida SDS com gradiente de 4%&amp;ndash;20%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Utilizado para análise de SDS-PAGE de proteínas associadas a esferas; armazenar a 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

reconstituindo a montagem de actina ramificada mediada por miosina-i em um ensaio de motilidade de caudas de cometa de actina baseado em esferas

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

A polimerização de actina ramificada mediada pelo complexo de proteína relacionada à actina 2/3 (Arp2/3) fornece as forças principais de propulsão para uma variedade de processos celulares, incluindo migração celular, endocitose e fagocitose. Motores de miosina-I, que frequentemente colocalizam com redes de actina ramificada na borda anterior da célula, também demonstraram participar desses processos e acredita-se que regulam a organização da rede de actina e sua produção mecânica. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais a miosina-I interage com o complexo Arp2/3 para modular a montagem de actina ramificada e a geração de força permanecem amplamente desconhecidos. Aqui, descrevemos um ensaio de motilidade de bastões com cauda de cometa de actina in vitro altamente ajustável que reconstitui a interação entre miosina-I, actina e o complexo Arp2/3 na borda anterior da célula sobre a superfície de bastões de tamanho micrométrico. Este método é adaptado de ensaios bem estabelecidos de cauda de cometa de actina pela imobilização conjunta de miosina-I com fatores promotores de nucleação (NPFs) nas superfícies dos bastões, criando assim uma interface de montagem de actina semelhante à membrana. O ensaio permite a visualização e análise quantitativa da montagem da rede de actina, densidade da rede, motilidade dos bastões e eficiência de crescimento. Também fornece leituras indiretas e qualitativas do aumento de força mediado pela miosina-I em redes de actina ramificada. Este protocolo inclui funcionalização de bastões, montagem da reação, imagem por fluorescência, análise quantitativa de imagens e estratégias de solução de problemas, oferecendo uma plataforma reprodutível para o estudo da montagem de actina regulada pela miosina-I em interfaces semelhantes à membrana.

O ensaio de motilidade de bastões com cauda de actina em cometa foi utilizado para investigar o efeito da atividade da miosina-I na montagem ramificada de actina mediada pelo complexo Arp2/3 na borda anterior da célula, recapitulando cenários nos quais a miosina-I associada à membrana coordena com a polimerização de actina para promover a protrusão da membrana7,8,9,10,11,12,13. Para imitar a colocalização da miosina-I e dos fatores de nucleação de actina (NPFs) na interface membrana-actina, ambas as proteínas foram coprecipitadas na superfície de bastões em escala micrométrica, reconstituindo assim sua proximidade espacial em um sistema in vitro controlado (Figura 1A,B).
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
Figura 1. Reconstituição da montagem de actina ramificada mediada por miosina-I em microesferas. (A) Esquema mostrando as interações entre miosina-I, fatores de promoção de nucleação (NPFs), o complexo da proteína relacionada à actina 2/3 (Arp2/3), proteína tampão (CP) e actina globular (G-actina) na borda anterior da célula. (B) Esquema da funcionalização das esferas. Esferas controle e esferas recobertas com miosina foram revestidas com NPF e neutravidina. A neutravidina foi conjugada com corante fluorescente vermelho-far-red biotinilado para as esferas controle ou com Drosophila Myo1d biotinilado para as esferas recobertas com miosina. (C) Séries temporais representativas mostrando o crescimento da cauda de cometa de actina desde a quebra de simetria até a formação da cauda de cometa polarizada, para uma esfera controle e uma esfera recoberta com miosina. O painel final mostra ambas as esferas no mesmo campo de visão. Barra de escala, 5 µm. Os painéis B e C são reproduzidos/modificados de Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
Para avaliar melhor a contribuição específica da miosina-I para a montagem da actina, uma esfera controle correspondente também foi construída. As esferas controle eram idênticas às esferas revestidas com miosina, exceto que a miosina-I foi substituída por um corante fluorescente biotinilado na faixa do vermelho distante conjugado à neutravidina (Figura 1B). A mistura dos dois tipos de esferas na mesma câmara de reação e sua imagem no mesmo campo de visão permitiram a comparação direta da montagem da actina ramificada na presença e na ausência de miosina-I sob condições experimentais idênticas (Figura 1C). Além disso, ao variar a proporção de miosina em relação ao NPF na superfície da esfera, o efeito da miosina-I em diferentes densidades superficiais pôde ser examinado sistematicamente (Figura 2A,B). Adicionalmente, a densidade da rede de actina pôde ser ajustada mediante a variação da concentração de CP, gerando redes que variam de estruturas densamente empacotadas, resistentes à quebra de simetria, a arquiteturas fracamente organizadas e propensas à fratura15,19,24. Essa abordagem permitiu investigar como a miosina-I influencia a montagem da actina ramificada em redes com diferentes densidades e integridade estrutural (Figura 2A,B).
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
Figura 2. Morfologia de cauda de cometa de actina&#160;em diferentes densidades superficiais de miosina e concentrações de proteína de capeamento. (A) Imagens de fluorescência representativas de 2-&#181;m-bolas de diâmetro revestidas com diferentes densidades superficiais de miosina e montadas em reações contendo 30–200 nM de proteína tampão (CP), 4 &#181;M actina com 5% de actina marcada com rodamina e 200 nM de Arp2/3&#160;complexo. Para cada condição, as perolas controle e as perolas revestidas com miosina foram imagiadas no mesmo campo de visão. As densidades superficiais de miosina e fator de nucleação promotor (NPF) foram determinadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio, conforme descrito no Passo 2.3. As imagens foram adquiridas 20–35 min após a iniciação da reação. O brilho e o contraste foram ajustados linear e identicamente dentro de cada par de perolas controle–miosina, mas foram escalonados independentemente entre as condições para melhor visualização. Barra de escala, 5 &#181;m. (BMapa qualitativo do ensaio resumindo os resultados das caudas de cometa em diferentes concentrações de CP e densidades superficiais de miosina. Cada ponto de dados representa um par de microesferas controle–miosina correspondido sob a condição indicada. Os símbolos indicam os resultados observados, incluindo microesferas revestidas com miosina promovendo quebra de simetria, caudas mais longas, caudas semelhantes, caudas mais curtas, ausência de formação de cauda de cometa ou estruturas em forma de asteroide. Os dados foram coletados a partir de mais de 20 experimentos independentes, com análise de mais de 10 pares de microesferas para cada condição. Esta figura é reproduzida/modificada de Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
Após a mistura dos componentes do ensaio, as NPFs ligadas à superfície estimularam a montagem ramificada de actina mediada pelo complexo Arp2/3 ao redor da superfície da esfera. Em uma reação bem-sucedida típica, a actina aparecia inicialmente como uma camada esparsa envolvendo a esfera. À medida que a polimerização progredia, a camada se expandia e a rede tornava-se mais densamente entrelaçada. A montagem contínua de actina na superfície da esfera promovia o crescimento externo da rede, o que poderia levar à quebra de simetria e à formação de uma cauda cometa polarizada. Uma vez estabelecida uma cauda cometa, a nucleação e polimerização contínuas de actina na superfície da esfera sustentavam o movimento contínuo da esfera (Figura 1C). Essas características sequenciais da formação da camada de actina, quebra de simetria, alongamento da cauda cometa e propulsão da esfera serviram como indicadores visuais de que o ensaio estava funcionando corretamente.
Conforme relatado em nosso estudo original18 e ilustrado na Figura 2A,B, a morfologia de cauda de cometa foi sensível tanto à concentração de CP quanto à densidade superficial de miosina. Em condições-padrão do ensaio (200 nM do complexo Arp2/3, 50 nM de CP, razão miosina:FNP = 0,43:1), as microesferas revestidas com miosina produziram, tipicamente, caudas de actina mais esparsas ou difusas do que as microesferas controle (Figura 2A). Em baixas concentrações de CP (&#60;30 nM), a actina se organizou em cascas densas e resistentes à fratura. Nessas condições, as microesferas controle frequentemente permaneceram encapsuladas e não sofreram quebra de simetria, enquanto as microesferas revestidas com miosina tinham maior probabilidade de romper a simetria e escapar da casca de actina circundante (Figura 2A,B). Em altas concentrações de CP (&#62;200 nM), a coesão da rede foi reduzida, e a presença de miosina desestabilizou ainda mais a rede de actina, promoveu a perda de actina e impediu a formação de caudas de cometa estáveis (Figura 2A,B). Esses resultados dependentes das condições fornecem parâmetros úteis que pesquisadores podem utilizar para identificar regimes apropriados de ensaio e solucionar problemas no desempenho do ensaio.
O efeito da miosina-I na morfologia da cauda cometa de actina pode ser avaliado pela medição da intensidade média de fluorescência da cauda cometa. A região da cauda cometa foi definida utilizando um limiar de intensidade, conforme descrito no Passo 4.2, e a intensidade média de fluorescência dentro dessa região foi então medida (Figura 3A). Em condições de imagem equivalentes, nas quais as esferas controle e as esferas revestidas com miosina foram imagiadas no mesmo campo de visão, esse valor serviu como uma medida relativa e não calibrada da densidade da rede de actina, sendo que uma intensidade média mais baixa indica uma rede mais esparsa. Em condições padrão do ensaio, as esferas revestidas com miosina geralmente geraram caudas cometas com intensidade média de fluorescência menor do que as esferas controle, o que é compatível com uma densidade aparente reduzida da rede (Figura 3C).
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
Figura 3. Fluxo de trabalho para quantificação da cinética de crescimento e eficiência de montagem de caudas cometárias de actina. (A) Séries temporais representativas do crescimento de cauda cometária a partir de uma esfera controle e de uma esfera revestida com miosina na proporção 0,43:1, na presença de 50 nM de proteína tampão (CP). Os contornos pretos indicam as regiões de interesse (ROIs) das caudas cometárias identificadas usando o Fiji para medições de intensidade de fluorescência. Condições da reação: 4 µM de actina com 5% de actina marcada com rodamina, 200 nM do complexo de proteína relacionada à actina 2/3 (Arp2/3) e 50 nM de CP. Barra de escala, 5 µm. (B) Comprimento da cauda cometária plotado em função do tempo para o par representativo de esferas controle e com miosina mostrado no painel (A). O inseto mostra a janela de tempo utilizada para o ajuste linear, e as taxas de crescimento da cauda foram determinadas a partir das inclinações das linhas ajustadas. (C) Intensidade total normalizada de fluorescência da cauda cometária plotada em função do tempo para o par representativo de esferas controle e com miosina mostrado no painel (A). As esferas controle e com miosina foram normalizadas à intensidade média de fluorescência das esferas controle entre 1100 e 1300 s. O inseto mostra a janela de tempo utilizada para o ajuste linear, e as taxas de montagem de fluorescência foram calculadas a partir das inclinações das linhas ajustadas. (D) Tabela resumo mostrando a taxa de crescimento da cauda, a taxa de montagem de fluorescência e a eficiência de crescimento para o par representativo de esferas controle e com miosina mostrado no painel (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
O efeito da miosina-I na cinética de crescimento da cauda de cometa pode ser quantificado pela medição do alongamento da cauda de cometa e do acúmulo de fluorescência da actina ao longo do tempo. Na maioria dos experimentos, as caudas de cometa cresceram com velocidade aproximadamente constante durante os primeiros ~10 min após a quebra de simetria. À medida que os componentes de polimerização foram se esgotando, o alongamento diminuiu progressivamente e geralmente cessou cerca de 30 min após o início da reação. Para quantificar a cinética de crescimento, o comprimento da cauda de cometa e a intensidade total de fluorescência foram plotados como funções do tempo (Figura 3B,C). Os primeiros 7–10 pontos de dados, correspondentes à fase linear inicial, foram ajustados usando regressão linear (Figura 3B,C, inserções). As inclinações desses ajustes representaram, respectivamente, a taxa inicial de crescimento da cauda e a taxa de montagem da fluorescência da actina. A eficiência de crescimento foi definida como a taxa de crescimento da cauda de cometa dividida pela taxa de montagem da fluorescência da actina, quantificando quão efetivamente a polimerização da actina foi convertida em deslocamento produtivo do corpúsculo (Figura 3D). No exemplo representativo mostrado na Figura 3A–D, o corpúsculo revestido com miosina exibiu uma taxa de crescimento da cauda de 0,60 µm/min (0,010 µm/s), comparada a 0,57 µm/min (0,0095 µm/s) para o corpúsculo controle (Figura 3B,D). As eficiências de crescimento correspondentes foram de 5,6 e 4,5 µm/unidade de intensidade, respectivamente, representando um valor aproximadamente 1,2 vezes maior para o corpúsculo revestido com miosina (Figura 3D). Em condições padrão, corpúsculos revestidos com miosina tipicamente exibiram taxas de crescimento comparáveis às dos corpúsculos controle (miosina: 0,69 ± 0,10 µm/min; controle: 0,66 ± 0,20 µm/min), juntamente com uma taxa de montagem de fluorescência da actina menor (aproximadamente 0,76 vezes a do controle) e uma eficiência de crescimento aproximadamente 1,4 vezes maior, conforme relatado anteriormente em nosso estudo original18. Esses valores são apresentados como média ± DP de 11 pares de corpúsculos por condição obtidos em cinco experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando um teste t pareado bicaudal, conforme descrito no estudo original18.
Para avaliar a contribuição do golpe de potência da miosina e descartar a possibilidade de que os efeitos observados tenham surgido de impedimento estérico devido à ocupação da superfície pela miosina, o ensaio de motilidade com microesferas pode ser realizado em condições que interrompem a atividade do golpe de potência da miosina-I. Neste protocolo, a atividade do motor da miosina-I foi inibida pela adição de 1,1 mM de Ca2+ à mistura de reação. O aumento de Ca2+ promoveu a dissociação da calmodulina do braço alavanca da miosina-I, reduzindo a rigidez do braço alavanca e prejudicando sua capacidade de gerar força46,47,48. Nessas condições, a miosina-I permaneceu dinamicamente associada à actina, mas não sustentou o deslizamento da actina (Figura 4A,B), fornecendo um controle útil para avaliar efeitos dependentes da atividade do motor18.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
Figura 4. Controle baseado em cálcio para avaliar a atividade motora da Myo1d no ensaio de motilidade de microesferas. (A) Imagens com tempo colapsado de filamentos de actina movendo-se sobre uma superfície revestida com Myo1d na ausência de cálcio elevado ou formando padrões giratórios não produtivos na presença de 100 µM de cálcio livre. A barra de cores arco-íris indica a progressão temporal ao longo de 61 quadros adquiridos em intervalos de 5 s. Barra de escala, 5 µm. (B) Quantificação da velocidade de deslizamento da actina na ausência e na presença de 100 µM de cálcio livre (N = 2 experimentos independentes; n = 25 filamentos). Nenhum deslizamento produtivo da actina foi observado na presença de 100 µM de cálcio livre nessas condições. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). (C) Pares representativos de microesferas controle e revestidas com miosina montados na ausência ou presença de 100 µM de cálcio livre. Cinco pares representativos de microesferas são mostrados para cada condição. Em cada par, a microesfera controle e a microesfera revestida com miosina foram imagiadas no mesmo campo de visão. As imagens foram adquiridas aproximadamente 15–20 min após o início da reação. O brilho e o contraste foram ajustados linearmente e de forma idêntica dentro de cada par de microesferas controle–miosina, mas foram escalonados independentemente entre as condições. Condições da reação: 4 µM de actina com 5% de actina marcada com rodamina, 200 nM do complexo proteína relacionada à actina 2/3 (Arp2/3) e 50 nM de proteína tampão (CP). Barras de escala, 5 µm. Os painéis A e B são reproduzidos/modificados de Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
Quando o ensaio foi realizado corretamente, as microesferas revestidas com miosina submetidas a condições de Ca2+ elevado geraram caudas cometiformes de actina mais curtas, com densidades de rede comparáveis às das microesferas controle (Figura 4C). São apresentados cinco pares representativos de microesferas controle e revestidas com miosina provenientes de dois experimentos independentes. Esse resultado qualitativo foi consistentemente observado em repetidas preparações do ensaio e é apoiado pela análise quantitativa relatada no estudo original18. Esse resultado esperado indica que as diferenças na rede observadas em condições padrão dependem do movimento ativo da miosina, e não apenas da ocupação da superfície pela miosina. Assim, a condição de Ca2+ elevado serve como um controle fundamental para avaliar se alterações na organização da rede de actina ramificada decorrem da atividade do motor de miosina.

Este protocolo descreve um ensaio de motilidade de grânulos com cauda de cometa de actina ajustável para investigar quantitativamente como a atividade do motor de miosina influencia a montagem da actina ramificada e a arquitetura da rede em uma interface semelhante à membrana.

Reconstituindo a Montagem de Actina Ramificada Mediada por Miosina-I em um Ensaio de Motilidade de Caudas de Cometa de Actina Baseado em Esferas

A polimerização de actina ramificada mediada pelo complexo de proteína relacionada à actina 2/3 (Arp2/3) fornece as principais forças de propulsão para uma variedade de...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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Bioengenharia

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