Imagem quantitativa de células vivas da forma nuclear e dinâmica da cromatina durante o desenvolvimento e estresse ambiental na raiz de Arabidopsis thaliana
5 de junho de 2026
Esse processo utiliza microscopia confocal em conjunto com um núcleo e linha marcadora de cromatina marcados fluorescentemente em Arabidopsis thaliana para registrar simultaneamente a dinâmica do núcleo e da cromatina nas raízes de Arabidopsis e investigar mudanças nessas dinâmicas em resposta a sinais de desenvolvimento e ambientais.
Nossa pesquisa investiga genes e mecanismos que possibilitam a recuperação radicular a longo prazo do estresse osmótico para fortalecer as culturas contra a seca. Embora desenvolvido para raízes de arabidopsis, esse protocolo pode ser adaptado a sistemas com linhas de marcadores de proteínas fluorescentes. Prepare as placas de crescimento contendo mudas de Arabidopsis thaliana para imagem.
Pipete 60 microlitros de água pura em um lâmina de vidro. Coloque três raízes de muda de A. thaliana com seis dias na água. Coloque uma cobertura número 1,5 milímetros de 22x22 milímetros sobre as raízes sem cobrir as folhas.
Nas configurações de microscópio confocal, ajuste o tempo de exposição do laser para 1.000 milissegundos. Nas configurações do combinador de laser, ajuste o laser de 488 nanômetros para 50% para imagem de proteína fluorescente verde, ou GFP. Ajuste o laser de 561 nanômetros para 50% para imagem de proteína fluorescente vermelha, ou RFP.
Faça a imagem da amostra usando uma lente objetiva 20X sem zoom óptico. Defina o tamanho do passo da fatia Z para 0,3 micrômetros. Defina o intervalo de imagem para um minuto e a duração total da imagem para 10 minutos.
Localize as raízes e selecione até 20 fatias Z. Capture imagens de 16 bits. Inicie a aquisição do time lapse e salve o time lapse como um arquivo TIFF usando compressão sem perdas.
Transferir os dados adquiridos para um computador para análise. Abra o software ImageJ ou Fiji. Clique e arraste o arquivo VSI para a janela principal do ImageJ ou do aplicativo Fiji.
No prompt Opções de Importação de Bio Formats, clique em OK no canto inferior direito. Depois, no prompt Opções de Série de Bio Formato, certifique-se de que a Série 1 está selecionada. Clique em OK no canto inferior esquerdo.
Uma vez que a imagem seja carregada, divida os sinais selecionando Imagem. Selecione Cor e escolha Dividir Canais. Veja as janelas separadas geradas para núcleos rotulados com GFP e cromatina rotulada com RFP.
Determine qual das duas janelas de imagem corresponde à cromatina. Após clicar na janela da imagem de cromatina, aplique a operação do projeto Z selecionando Imagem, escolhendo Stacks e então clicando em Projeto Z na janela principal do ImageJ. Mude o tipo de projeção para intensidade máxima.
Certifique-se de que Todos os Períodos de Tempo esteja ativo e clique em OK para gerar a projeção. Abra o menu de contraste pressionando Control Shift C, ou selecionando Imagem e escolhendo Ajustar, e então clicando em Brilho ou Contraste na janela principal do ImageJ. Deslize a barra mínima para a esquerda até que a cromatina fique claramente visível.
Navegue até os plugins. Clique na seta para baixo no menu Plugins para deslizar até a opção de Rastreamento. Selecione Rastreamento e clique em TrackMate.
Confirme se as configurações de calibração estão corretas e clique em Próximo. Selecione Detector de Limiar e clique em Próximo. Avance para o último quadro do time lapse na janela da imagem.
Clique em Auto ao lado do Limiar de Intensidade e clique em Prévia. Ajuste o Limiar de Intensidade e clique em Prévia. Repita o processo de ajuste e pré-visualização até que toda a cromatina esteja incluída com o mínimo de ruído, e clique em Próximo.
Permita que a detecção inicial de limiar seja concluída e clique em Próximo. Ajuste manualmente o limiar até que apenas a cromatina fique visível e clique em Próximo. Ajuste a tela de imagem de fluorescência e clique em Próximo.
Selecione Rastreador LAP Simples e clique em Próximo. Defina a distância máxima de ligação para 5 micrômetros, a distância máxima de fechamento para 15 micrômetros, a distância máxima de fechamento para 1, e clique em próximo. Permita que o rastreamento seja concluído.
Observe as faixas exibidas na janela original da imagem e clique em Próximo. Pressione o botão verde mais no canto inferior esquerdo para criar um filtro. Selecione o número de vagas no modo pista.
Ajuste o controle deslizante de limiar. Certifique-se de que o modo filtro esteja definido para Acima e depois clique em Próximo. Clique no botão Trilhas no final da página de Opções de Exibição.
Selecione Exportar para CSV. Ignore a página de plotamento embutida e clique em Próximo. Revise os resultados da análise do TrackMate.
Clique em Capturar Overlay e então selecione Executar. Salve o vídeo selecionando Arquivo e clicando em Salvar Como, e depois escolhendo GIF. As células radiculares tratadas com sal mostraram estresse, e os focos centroméricos apareceram maiores do que em condições de controle.
A velocidade da cromatina foi significativamente maior em condições de controle do que em condições tratadas com cloreto de sódio de 100 milimolares. Esse protocolo permite o acompanhamento e quantificação do movimento de proteínas marcadas fluorescentemente ao longo do tempo nas raízes de arabidopsis. O desafio mais importante desse protocolo é obter imagens de alta qualidade, já que o clareamento fotográfico e o desvio da amostra podem dificultar o acompanhamento.
Estudos futuros devem investigar os mecanismos subjacentes à redução do movimento da cromatina observado em nosso estudo.
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Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
