Imagem quantitativa de células vivas da forma nuclear e dinâmica da cromatina durante o desenvolvimento e estresse ambiental na raiz de Arabidopsis thaliana
5 de junho de 2026
Esse processo utiliza microscopia confocal em conjunto com um núcleo e linha marcadora de cromatina marcados fluorescentemente em Arabidopsis thaliana para registrar simultaneamente a dinâmica do núcleo e da cromatina nas raízes de Arabidopsis e investigar mudanças nessas dinâmicas em resposta a sinais de desenvolvimento e ambientais.
Nossa pesquisa investiga genes e mecanismos que possibilitam a recuperação radicular a longo prazo do estresse osmótico para fortalecer as culturas contra a seca. Embora desenvolvido para raízes de arabidopsis, esse protocolo pode ser adaptado a sistemas com linhas de marcadores de proteínas fluorescentes. Prepare as placas de crescimento contendo mudas de Arabidopsis thaliana para imagem.
Pipete 60 microlitros de água pura em um lâmina de vidro. Coloque três raízes de muda de A. thaliana com seis dias na água. Coloque uma cobertura número 1,5 milímetros de 22x22 milímetros sobre as raízes sem cobrir as folhas.
Nas configurações de microscópio confocal, ajuste o tempo de exposição do laser para 1.000 milissegundos. Nas configurações do combinador de laser, ajuste o laser de 488 nanômetros para 50% para imagem de proteína fluorescente verde, ou GFP. Ajuste o laser de 561 nanômetros para 50% para imagem de proteína fluorescente vermelha, ou RFP.
Faça a imagem da amostra usando uma lente objetiva 20X sem zoom óptico. Defina o tamanho do passo da fatia Z para 0,3 micrômetros. Defina o intervalo de imagem para um minuto e a duração total da imagem para 10 minutos.
Localize as raízes e selecione até 20 fatias Z. Capture imagens de 16 bits. Inicie a aquisição do time lapse e salve o time lapse como um arquivo TIFF usando compressão sem perdas.
Transferir os dados adquiridos para um computador para análise. Abra o software ImageJ ou Fiji. Clique e arraste o arquivo VSI para a janela principal do ImageJ ou do aplicativo Fiji.
No prompt Opções de Importação de Bio Formats, clique em OK no canto inferior direito. Depois, no prompt Opções de Série de Bio Formato, certifique-se de que a Série 1 está selecionada. Clique em OK no canto inferior esquerdo.
Uma vez que a imagem seja carregada, divida os sinais selecionando Imagem. Selecione Cor e escolha Dividir Canais. Veja as janelas separadas geradas para núcleos rotulados com GFP e cromatina rotulada com RFP.
Determine qual das duas janelas de imagem corresponde à cromatina. Após clicar na janela da imagem de cromatina, aplique a operação do projeto Z selecionando Imagem, escolhendo Stacks e então clicando em Projeto Z na janela principal do ImageJ. Mude o tipo de projeção para intensidade máxima.
Certifique-se de que Todos os Períodos de Tempo esteja ativo e clique em OK para gerar a projeção. Abra o menu de contraste pressionando Control Shift C, ou selecionando Imagem e escolhendo Ajustar, e então clicando em Brilho ou Contraste na janela principal do ImageJ. Deslize a barra mínima para a esquerda até que a cromatina fique claramente visível.
Navegue até os plugins. Clique na seta para baixo no menu Plugins para deslizar até a opção de Rastreamento. Selecione Rastreamento e clique em TrackMate.
Confirme se as configurações de calibração estão corretas e clique em Próximo. Selecione Detector de Limiar e clique em Próximo. Avance para o último quadro do time lapse na janela da imagem.
Clique em Auto ao lado do Limiar de Intensidade e clique em Prévia. Ajuste o Limiar de Intensidade e clique em Prévia. Repita o processo de ajuste e pré-visualização até que toda a cromatina esteja incluída com o mínimo de ruído, e clique em Próximo.
Permita que a detecção inicial de limiar seja concluída e clique em Próximo. Ajuste manualmente o limiar até que apenas a cromatina fique visível e clique em Próximo. Ajuste a tela de imagem de fluorescência e clique em Próximo.
Selecione Rastreador LAP Simples e clique em Próximo. Defina a distância máxima de ligação para 5 micrômetros, a distância máxima de fechamento para 15 micrômetros, a distância máxima de fechamento para 1, e clique em próximo. Permita que o rastreamento seja concluído.
Observe as faixas exibidas na janela original da imagem e clique em Próximo. Pressione o botão verde mais no canto inferior esquerdo para criar um filtro. Selecione o número de vagas no modo pista.
Ajuste o controle deslizante de limiar. Certifique-se de que o modo filtro esteja definido para Acima e depois clique em Próximo. Clique no botão Trilhas no final da página de Opções de Exibição.
Selecione Exportar para CSV. Ignore a página de plotamento embutida e clique em Próximo. Revise os resultados da análise do TrackMate.
Clique em Capturar Overlay e então selecione Executar. Salve o vídeo selecionando Arquivo e clicando em Salvar Como, e depois escolhendo GIF. As células radiculares tratadas com sal mostraram estresse, e os focos centroméricos apareceram maiores do que em condições de controle.
A velocidade da cromatina foi significativamente maior em condições de controle do que em condições tratadas com cloreto de sódio de 100 milimolares. Esse protocolo permite o acompanhamento e quantificação do movimento de proteínas marcadas fluorescentemente ao longo do tempo nas raízes de arabidopsis. O desafio mais importante desse protocolo é obter imagens de alta qualidade, já que o clareamento fotográfico e o desvio da amostra podem dificultar o acompanhamento.
Estudos futuros devem investigar os mecanismos subjacentes à redução do movimento da cromatina observado em nosso estudo.
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Visão Geral
O núcleo em células eucarióticas exibe mudanças dinâmicas de forma, que são alteradas sob condições de estresse, como câncer em animais ou estresse abiótico em plantas. Este estudo desenvolveu um fluxo de trabalho de imagem em tempo real em raízes de Arabidopsis thaliana utilizando marcadores fluorescentes duplos para o envelope nuclear e a cromatina, a fim de quantificar a dinâmica nuclear e da cromatina sob condições controle e sob estresse salino. A microscopia confocal combinada com Fiji/ImageJ e TrackMate permitiu a análise quantitativa, revelando movimento reduzido da cromatina sob estresse salino. O método fornece uma abordagem robusta para estudar como os estressores abióticos afetam a arquitetura nuclear e a dinâmica da cromatina em células vegetais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular de plantas
- Dinâmica nuclear
- Mobilidade da cromatina
- Resposta ao estresse abiótico
Contexto
- A forma do núcleo é dinâmica em células vivas, não estática como tradicionalmente representada.
- Mudanças na morfologia nuclear estão associadas ao câncer em células animais e ao estresse ambiental em plantas.
- O envelope nuclear interage com a cromatina para influenciar a expressão gênica.
- Existe conhecimento limitado sobre como o estresse abiótico afeta a forma nuclear, o movimento e a dinâmica da cromatina em plantas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um fluxo de trabalho para quantificar a dinâmica nuclear e da cromatina em células vegetais vivas.
- Aplicar este método para avaliar alterações sob estresse abiótico, especificamente estresse salino.
- Validar a abordagem mediante a medição do movimento da cromatina em condições controle e sob estresse.
- Permitir análises futuras das respostas nucleares e da cromatina a agentes estressores ambientais em raízes de Arabidopsis.
Métodos Utilizados
- Imagem de células vivas de raízes de Arabidopsis thaliana utilizando microscopia confocal.
- Uso de uma linhagem marcadora com dupla marcação fluorescente (proteína da envoltória nuclear e cromatina).
- Aquisição de imagens em condições de controle e sob estresse salino.
- Análise da dinâmica nuclear e da cromatina utilizando Fiji/ImageJ com o plugin TrackMate.
- Rastreamento de partículas para quantificar a velocidade e o movimento da cromatina.
Resultados Principais
- O movimento da cromatina foi significativamente reduzido em raízes sob estresse salino em comparação com o controle.
- O sistema de dupla marcação permitiu a visualização simultânea da envoltória nuclear e da cromatina.
- O TrackMate permitiu o rastreamento preciso de partículas e a quantificação das dinâmicas.
- O método conseguiu capturar com sucesso alterações quantitativas em tempo real no comportamento nuclear e da cromatina.
Conclusões
- O pipeline desenvolvido permite a imagem quantitativa em tempo real de células vivas da forma nuclear e da dinâmica da cromatina em raízes de plantas.
- O estresse salino leva à diminuição da mobilidade da cromatina, indicando alterações na dinâmica nuclear sob estresse abiótico.
- Essa abordagem pode ser aplicada para estudar as respostas nucleares a diversos agentes estressores ambientais.
- O método fornece uma base para vincular a arquitetura nuclear à regulação gênica e à adaptação ao estresse em plantas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem quantitativa em tempo real de células vivas da forma do núcleo e da dinâmica da cromatina em raízes de Arabidopsis fornece uma plataforma robusta para analisar as respostas celulares ao estresse ambiental com alta resolução. Esta abordagem permite confiança preditiva na associação de alterações na arquitetura nuclear com a regulação gênica, apoiando descobertas precoces e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de biotecnologia vegetal. As saídas quantitativas do método facilitam decisões ajustadas ao risco para o desenvolvimento de características e pesquisas sobre adaptação ao estresse.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação do comportamento nuclear e da cromatina sob condições de estresse definidas.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao quantificar respostas nucleares dinâmicas a estímulos abióticos.
- Facilita a validação funcional de alvos associados à envelope nuclear e à cromatina.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Oferece ensaios padronizados e quantitativos de imagem para dinâmicas nucleares e da cromatina.
- Permite a medição reprodutível de alterações induzidas por estresse em células vegetais vivas.
- Permite triagem em larga escala de moduladores genéticos ou químicos que afetam a arquitetura nuclear.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dinâmicas nucleares e da cromatina com fenótipos de adaptação ao estresse em sistemas modelo.
- Permite a continuidade da descoberta à validação pré-clínica de características de resiliência ao estresse.
- Apoia a desmistificação preditiva para pesquisas translacionais no melhoramento de culturas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho de imagem e análise integra desde a descoberta inicial até a triagem e a pesquisa translacional em biotecnologia vegetal.
- Biologia da Descoberta: Quantifica as dinâmicas nucleares e da cromatina para esclarecer as vias de resposta ao estresse.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece rastreamento de partículas e saídas estatísticas para comparação robusta entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações na arquitetura nuclear com a adaptação ao estresse, apoiando a validação de características.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho de imagem e análise reutilizável, adaptável a diversos modelos vegetais e agentes estressores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos nucleares e da cromatina.
- Valor Operacional: Padroniza a microscopia em tempo real em células vivas e a análise quantitativa para garantir reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento de características de adaptação ao estresse.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de intervenções genéticas ou químicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal e imagem de células vivas.
- Necessita acesso a linhagens com marcadores fluorescentes duplos e software de análise de imagens (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Exige padronização entre equipes para protocolos de aquisição de imagens e análise de dados.
- Adaptável a outras espécies vegetais mediante desenvolvimento adequado de marcadores.
- Limitado pela disponibilidade de marcadores fluorescentes compatíveis para os sistemas-alvo.
