Caracterização funcional de parceiros pré e pós-sinápticos individuais no sistema nervoso central larvar de Drosophila usando CaMPARI

Nossa pesquisa foca na avaliação da conectividade sináptica funcional entre parceiros definidos de linfonodos neurais em larvas vivas e dissecadas de Drosophila. Métodos convencionais exigem dissecação ou estimulação física. Esse protocolo utiliza optogenética em larvas intactas, reduzindo artefatos.

Para começar, derreta o meio de ágar de farinha de milho no micro-ondas por 8-10 segundos sem ferver e deixe esfriar em temperatura ambiente sem solidificar. Antes do resfriamento completo, adicione all-trans-retinal, ou ATR, a uma concentração de 0,5 milimolar para suplementar o meio para moscas que necessitam de ativação de csChrimson. Cubra completamente os frascos com papel alumínio para evitar a exposição à luz.

Cruzar mulheres virgens portadoras dos genes CaMPARI e csChrimson com machos portadores dos genes condutores GAL4 e LexA em frascos plásticos contendo o meio preparado. Prepare frascos paralelos sem ATR como controle. Incube os frascos a 25 graus Celsius até que as larvas atinjam o estágio do terceiro instar.

Use um pincel para coletar uma larva de terceiro ínstar. Enxágue a larva em uma placa micro pontual de três poços contendo 0,1 molar de PBS para remover qualquer alimento aderente. Coloque uma pequena quantidade de argila de modelar em cada canto de uma capa limpa de 18 x 18 milímetros.

Coloque a larva em uma gota de PBS na capa e permita que ela oriente o lado ventral para baixo. Coloque uma lâmina limpa de microscópio sobre a cobertura contendo a larva. Fixe a cobertura aplicando argila de modelar nos cantos, usando pressão suficiente para imobilizar a larva sem esmagá-la ou quebrar o vidro.

Coloque a lâmina contendo a larva no palco de um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva 40x/1,2. Na interface do software do microscópio, clique em Live. Depois, no painel do Z Stack, clique em Set First e depois Set Last seguido de Stop para adquirir um Z Stack de neurônios pós-sinápticos de referência, expressando CaMPARI.

No menu Canais, defina o canal verde de 488 nanômetros com 0,8% de potência do laser. Em seguida, ajuste o canal vermelho de 561 nanômetros para 0,8% de potência do laser. No menu Z Stack, defina o valor do Intervalo para 1 micrômetro.

No menu de Aquisição, escolha Presets para definir a resolução de 256 x 256 pixels. Uma linha com valor médio de 2, varredura bidirecional e velocidade de varredura de 9, permitindo atualização automática do tempo de pixel. Realize todas as imagens em um ambiente escuro, mantendo parâmetros de aquisição idênticos durante todo o experimento.

Ajuste a luz de fotoconversão de 405 nanômetros para 0,5% de potência do laser. E a luz optogenética de 561 nanômetros para 0,8% de potência do laser. Clique em Live, depois selecione Melhor Ajuste no painel de Histograma.

Permita que ambos os lasers estimulem a larva simultaneamente por 30 segundos, depois interrompa a estimulação. Durante a aquisição de ZStack pós-estimulação usando os mesmos parâmetros da linha base, observe fluorescência vermelha de CaMPARI em neurônios estimulados a laser de larvas alimentadas com ATR, com fotoconversão e controles mínimos. No software Fiji ImageJ, clique em Arquivo e depois escolha Abrir.

Na janela de opções de importação do BioFormat com as configurações padrão, clique em OK para abrir a imagem adquirida do ZStack. No menu Imagem, escolha Colorir e depois Dividir Canais para visualizar os canais vermelho e verde da imagem adquirida. Para subtração de fundo, clique em Processar, depois selecione Subtrair Fundo.

Na janela pop-up, defina o raio da bola rolante para 50 pixels, depois clique em OK e selecione Sim na janela Processar Stack. Em seguida, no menu Analisar, selecione Ferramentas e depois escolha Gerenciador de ROI para abrir a janela de ROI. Use a ferramenta de seleção à mão livre para delinear regiões de interesse ao redor de células individuais.

Na janela de ROI, selecione Adicionar para salvar o esboço selecionado. Depois, clique em Medir para gerar resultados de área, média, desvio padrão e densidade integrada. Repetindo o processo para múltiplas células da mesma larva em canais verde e vermelho separadamente.

Após exportar os resultados para uma planilha, meça a razão vermelho para verde ou R por G das densidades integradas para cada célula e faça a média desses valores para calcular a média R por G por larva tanto para as imagens pré quanto pós-estimulação. Por fim, calcule a variação na fluorescência ou delta R por G subtraindo a razão R por G pré-estimulação da razão R por G pós-estimulação para quantificar a atividade de cálcio pós-sináptica. Os estudos de conectividade funcional entre neurônios de arborização dendrítica classe IV ou cIVda e interneurônios da bacia 4 em larvas de terceiro ínstar mostraram que os interneurônios da bacia 4 apresentavam fluorescência verde devido à expressão citosólica de CaMPARI antes da fotoconversão e da estimulação optogênica da luz.

Nenhuma fluorescência vermelha foi detectada sob condições de base, confirmando a ausência de fotoconversão antes da estimulação. A exposição simultânea à luz por fotoconversão e a estimulação optogenética resultaram na fotoconversão CaMPARI de fluorescência verde para vermelha. A ausência de fluorescência vermelha no controle indica que a fotoconversão foi especificamente impulsionada pela atividade neuronal mediada por csChrimson.

A fluorescência Delta vermelho por verde foi significativamente maior em animais experimentais do que em nenhum controle ATR. Esse protocolo pode ser usado para confirmar a parceria sináptica, permitindo o acompanhamento da estimulação pré-sináptica seguida de respostas imediatas pós-sinápticas em animais vivos em desenvolvimento. O passo mais desafiador é que a imobilização adequada do animal exigirá pressão suficiente para evitar o movimento sem prejudicar o animal.

Estudos futuros podem permitir o rastreamento, a formação, fortalecimento e até a eliminação de conexões sinápticas entre populações neuronais específicas durante o desenvolvimento de um animal.