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Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Biologia do Câncer e Terapêutica de Precisão, Universidade Médica da China, no âmbito do Programa de Centros de Pesquisa em Áreas de Destaque dentro do projeto Higher Education Sprout Project do Ministério da Educação (MOE) em Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2).
Agradecemos ao Centro de Biologia do Câncer e Terapêutica de Precisão pelo financiamento e apoio acadêmico fornecidos.

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Várias etapas deste protocolo são fundamentais para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Primeiramente, a qualidade e pureza do isolamento de PBMCs influenciam diretamente o rendimento de macrófagos e a eficiência de diferenciação. A sobreposição cuidadosa do sangue diluído sobre o gradiente de Ficoll e a centrifugação com o freio desligado são essenciais para preservar a interface da camada de buffy coat. A lise incompleta de hemácias ou incubação excessiva com o tampão de lise comprometerá a viabilidade dos PBM...

O câncer de mama é a malignidade mais frequentemente diagnosticada entre as mulheres em todo o mundo, correspondendo a aproximadamente 2,3 milhões de novos casos anualmente1. A doença é clinicamente heterogênea e é classificada em pelo menos quatro subtipos moleculares principais com base no status dos receptores hormonais — receptor de estrogênio (RE) e receptor de progesterona (RP) — e na expressão do oncogene do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2)2. Os tumores luminais A expressam RE e/ou RP sem superexpressão de HER2 (RE/RP+ e HER2−); os tumores luminais B coexpressam RE/RP e HER2 (RE/RP+ e HER2+); os tumores HER2+ são caracterizados por alta expressão de HER2, independentemente do status dos receptores hormonais; e o câncer de mama triplo negativo (CMTN) não expressa nenhum dos três marcadores (RE−, RP− e HER2−)2,3. Dentre esses subtipos, o CMTN representa a forma clinicamente mais desafiadora e corresponde a aproximadamente 15%–20% de todos os cânceres de mama. Pacientes com CMTN apresentam o curso da doença mais agressivo, com o pior prognóstico e menor sobrevida global em 5 anos, devido à baixa resposta à quimioterapia convencional e à ausência de terapias direcionadas eficazes3,4. Além disso, o CMTN exibe uma propensão significativamente alta à metástase visceral, particularmente para os pulmões dentro de 5 anos do diagnóstico, e pacientes com CMTN avançado ou metastático (CMTNM) têm uma sobrevida mediana que raramente ultrapassa 2 anos5,6. Essas estatísticas destacam a necessidade crítica e não atendida de novas estratégias terapêuticas para o CMTN.
O microambiente tumoral (MAT) desempenha um papel fundamental na progressão do câncer de mama e na evasão imunológica. Os macrófagos associados ao tumor estão entre as células imunes mais abundantes dentro do MAT e recentemente foram reconhecidos como mediadores críticos da imunidade inata contra o tumor7,8,9. Embora os macrófagos associados ao tumor tenham sido historicamente divididos em estados pró-inflamatórios “M1” e pró-tumorais “M2”, esse modelo binário não consegue capturar a verdadeira extensão da heterogeneidade dos macrófagos. Em vez disso, os macrófagos associados ao tumor ocupam um espectro funcional dinâmico, evoluindo em resposta aos diversos sinais bioquímicos presentes no MAT. Nessa paisagem complexa, as células tumorais subvertem ativamente a atividade dos macrófagos por meio de várias estratégias de evasão imunológica, notadamente a superexpressão de sinais de “não me coma”. O eixo CD47/SIRPα foi o primeiro ponto de controle imunológico inato identificado nesse contexto6,10, e mais recentemente, o CD24 surgiu como um novo e potente sinal anti-fagocítico11,12. O CD24 é uma glicoproteína de tipo mucina pequena e altamente glicosilada, ancorada à membrana celular por meio de uma ligação glicosilfosfatidilinositol13. Ele é expresso em várias linhagens de células imunes em condições fisiológicas, mas é frequentemente superexpresso em tumores sólidos, incluindo cânceres de mama, ovário, pâncreas e colorretal14. Em células tumorais, o CD24 interage com o receptor inibitório sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) expresso nos macrófagos. Essa interação desencadeia a fosforilação dos domínios de motivo inibitório baseado em tirosina do receptor imunológico na cauda citoplasmática do Siglec-10, ativando as fosfatases SHP-1 e SHP-2 que suprimem a sinalização fagocítica downstream11. A inibição da interação CD24/Siglec-10 com anticorpo monoclonal demonstrou aumentar robustamente a fagocitose de tumores humanos que expressam CD24 pelos macrófagos. Nosso estudo recente também mostrou que a eliminação do CD24a em células de câncer de mama aumenta sua suscetibilidade à fagocitose por macrófagos em um modelo murino de câncer de mama triplo negativo9.
A fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) é um mecanismo fundamental pelo qual os anticorpos direcionam os macrófagos a fagocitar células tumorais15,16. Após se ligarem a antígenos expressos pelas células tumorais, as regiões Fc dos anticorpos interagem com os receptores Fcγ (FcγR) presentes nos macrófagos, desencadeando cascatas de sinalização intracelular que resultam no rearranjo do citoesqueleto, formação da cúpula fagocítica e englobamento da célula-alvo17.
Neste estudo, desenvolvemos e validamos um protocolo de imagem celular vital com lapso de tempo para medir a fagocitose mediada por anticorpos de células de câncer de mama por macrófagos. O método utiliza macrófagos derivados de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores humanos saudáveis, diferenciados com fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e posteriormente estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) e interferon gama (IFN-γ). A análise por citometria de fluxo confirmou a superexpressão de CD80 dentro da população CD11b⁺ após a estimulação (Figura 1), apoiando o fenótipo classificadamente ativado. Esse estado de ativação confere uma capacidade robusta de fagocitose mediada por anticorpos, tornando-o adequado para avaliar a fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP). Células de câncer de mama positivas para CD24 marcadas com GFP servem como células-alvo e são opsonizadas com um anticorpo monoclonal terapêutico anti-CD24 antes da cocultura. Os eventos fagocíticos são registrados ao longo de um período de 16 h usando um microscópio automatizado sob condições ambientais controladas. Para permitir uma avaliação quantitativa em paralelo com a visualização dinâmica, um ensaio de ponto final separado é realizado sob condições idênticas de cocultura, permitindo uma medição rigorosa da fagocitose após a remoção das células-alvo não internalizadas. Este protocolo fornece uma plataforma padronizada, reprodutível e visualmente informativa para avaliar a ADCP mediada por um anticorpo anti-CD24. Importante, a integração da imagem com lapso de tempo com uma estratégia complementar de quantificação baseada em ponto final permite a avaliação simultânea da cinética e da magnitude da fagocitose. O método pode ser adaptado para investigar outros alvos imunoterapêuticos direcionados a macrófagos. Este protocolo é mais adequado para avaliar a ADCP mediada por anticorpos monoclonais terapêuticos contra antígenos de superfície em células cancerígenas. É especialmente indicado para triagem comparativa de anticorpos candidatos, caracterização de resposta à dose e estudos mecanicistas do engajamento Fc–FcγR, incluindo os efeitos do bloqueio do sinal “não me coma” (por exemplo, CD47–SIRPα). Como o ensaio utiliza macrófagos humanos primários, também é apropriado para estudos translacionais que exigem avaliação da variabilidade entre doadores antes do desenvolvimento clínico.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
Figura 1. Geração e validação por citometria de fluxo de macrófagos estimulados com IFN-γ/LPS derivados de células mononucleares do sangue periférico. Painel superior: Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são isoladas de doadores saudáveis por meio de centrifugação em gradiente de densidade utilizando solução de Ficoll a 400 × g durante 30 min a 20°C, com todos os reagentes previamente equilibrados a 20°C ± 2°C. Os PBMCs isolados são cultivados em meio ImmunoCult-SF suplementado com 100 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) por 7 dias para induzir a diferenciação em macrófagos (Dia 0–7), com reposição do meio no Dia 5. No Dia 8, os macrófagos diferenciados são estimulados com 100 ng/mL de IFN-γ e 1 µg/mL de LPS por 48 h (Dia 8–10). As células são então submetidas à análise por citometria de fluxo. Painel inferior: Análise por citometria de fluxo de macrófagos. As células foram marcadas com um painel de superfície composto por CD11b-FITC, CD80-PE e CD206-PerCP-Cy5.5, seguido pela adição de DAPI antes da aquisição para exclusão de células mortas. Estratégia de seleção (gating): Primeiramente, as células foram selecionadas com base na viabilidade (DAPI⁻), seguido pela identificação de CD11b⁺ em um gráfico de CD11b-FITC versus FSC-A para confirmar a identidade de macrófago. Os eventos viáveis CD11b⁺ foram então analisados em um gráfico de dispersão de CD80 versus CD206 para confirmar a população CD80⁺CD206⁻ induzida pela estimulação com IFN-γ/LPS. À direita: Gráfico de dispersão representativo de CD11b-FITC versus FSC-A mostrando que 99,8% das células selecionadas foram CD11b⁺, confirmando a identidade de macrófago. À esquerda: A maioria das células CD11b⁺ estava dentro do quadrante CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2%), indicando o fenótipo pró-inflamatório esperado sob as condições de estimulação aplicadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
Os usuários devem considerar várias limitações ao aplicar esta técnica. Primeiro, a variabilidade entre doadores em macrófagos derivados de PBMCs pode introduzir uma variação substancial na atividade fagocítica, e recomendamos o uso de múltiplos doadores (n ≥ 3), com os dados individuais de cada doador relatados juntamente com os resultados agrupados. Segundo, o formato de co-cultura em 2D não recapitula o microambiente tumoral, e os achados devem ser validados em modelos tridimensionais ou in vivo antes de qualquer inferência clínica. Terceiro, a janela de imagem de 16 horas capta eventos fagocíticos iniciais, mas não reflete processos de longo prazo, como a apresentação de antígenos ou a ativação imune secundária. Assim, o uso combinado de imagem em tempo real e quantificação no ponto final fornece um arcabouço complementar que aumenta tanto a interpretabilidade quanto a reprodutibilidade das medidas de ADCP.

<table><tbody><tr><td>Solução estoque de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M</td><td>Sigma-Aldrich (ou equivalente)</td><td>E7889 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para preparar solução estoque de EDTA 10 mM em PBS para destacamento celular</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 24 poços (tratadas para cultura de tecidos)</td><td>Corning (ou equivalente)</td><td>3524</td><td>Utilizado para co-cultivo de macrófagos e células cancerígenas durante ensaio de fagocitose</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD206 humano (citometria de fluxo)</td><td>BioLegend (ou equivalente)</td><td>321122 (ou equivalente)</td><td>Marcador para fenótipo alternativo de macrófago</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-humano CD24</td><td>Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)</td><td>MA1-91384 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para opsonizar células cancerígenas para fagocitose dependente de anticorpos</td></tr><tr><td>Sistema automatizado de imagem em tempo real de células vivas com câmara de controle ambiental (por exemplo, Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (ou equivalente)</td><td>Microscópio Automatizado BioTek Lionheart FX</td><td>Permite a aquisição de imagens de lapso de tempo de longa duração sob temperatura controlada e &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; condições</td></tr><tr><td>Software de imagem para microscopia automatizada de células vivas (por exemplo, Gen5)</td><td>Agilent Technologies (ou equivalente)</td><td>N/A</td><td>Utilizado para a aquisição e análise de dados de imagens com lapso de tempo</td></tr><tr><td>Centrífuga (rotor de balde oscilante)</td><td>Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)</td><td>Multifuge X4R Pro com rotor TX-1000 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para o isolamento de PBMCs e etapas de lavagem celular</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubadora (37&amp;deg;C, 5% &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)</td><td>Forma Direct Heat &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubadora (ou equivalente)</td><td>Mantém as condições fisiológicas para o cultivo celular</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; fonte de gás com regulador</td><td>Agilent Technologies (ou equivalente)</td><td>N/A</td><td>Materiais &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; para controle ambiental de incubadora e sistema de imagem</td></tr><tr><td>Tubos cónicos (15 mL e 50 mL)</td><td>Corning (ou equivalente)</td><td>352070 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para o isolamento, lavagem e etapas de centrifugação de PBMCs</td></tr><tr><td>Tubos de coleta de sangue revestidos com EDTA (vacutainers)</td><td>BD Biosciences (ou equivalente)</td><td>367863 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para a coleta de amostras de sangue total de doadores</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (ou equivalente)</td><td>17144003 (ou equivalente)</td><td>Meio de gradiente de densidade para isolamento de PBMCs</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo (por exemplo, FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (ou equivalente)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Utilizado para análise fenotípica de macrófagos</td></tr><tr><td>Contas de compensação (citometria de fluxo)</td><td>Biolegend (ou equivalente)</td><td>424602</td><td>Utilizado para controles de compensação de uma única cor</td></tr><tr><td>anticorpo FITC anti-CD11b humano (citometria de fluxo)</td><td>BioLegend (ou equivalente)</td><td>101205 (ou equivalente)</td><td>Marcador utilizado para identificar macrófagos</td></tr><tr><td>anticorpo PE anti-humano CD80 (citometria de fluxo)</td><td>BioLegend (ou equivalente)</td><td>375410 (ou equivalente)</td><td>Marcador associado ao fenótipo de macrófago ativado</td></tr><tr><td>Linha celular de câncer de mama que expressa GFP (MDA-MB-468)</td><td>ATCC (ou equivalente)</td><td>HTB-132 (ou equivalente)</td><td>Células-alvo utilizadas no ensaio de fagocitose; GFP permite a visualização</td></tr><tr><td>Meio ImmunoCult-SF para macrófagos</td><td>STEMCELL Technologies (ou equivalente)</td><td>10961 (ou equivalente)</td><td>Meio livre de soro utilizado para a diferenciação de macrófagos</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Meio de Eagle Modificado (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)</td><td>12100046</td><td>Utilizado para o cultivo e ressuspendimento de células cancerígenas</td></tr><tr><td>Anticorpo controle de isotipo (IgG)</td><td>Bio X Cell (ou equivalente)</td><td>BE0297 (ou equivalente)</td><td>Controle negativo para o ensaio de fagocitose dependente de anticorpos</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (ou equivalente)</td><td>L2630 (ou equivalente)</td><td>Estímulo utilizado para ativar macrófagos em combinação com IFN-&amp;gamma;</td></tr><tr><td>Interferon gama humano recombinante (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (ou equivalente)</td><td>78020 (ou equivalente)</td><td>Citoquina utilizada para ativação de macrófagos</td></tr><tr><td>Fator estimulador de colônias de macrófagos humano recombinante (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (ou equivalente)</td><td>78057 (ou equivalente)</td><td>Fator de crescimento utilizado para a diferenciação de macrófagos</td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur ou pipetas serológicas</td><td>Jetbiofil (ou equivalente)</td><td>GSP010010 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para manipulação de líquidos durante o isolamento de PBMCs e cultivo celular</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-livre</td><td>Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)</td><td>BP399-500 (ou equivalente)</td><td>Tampão utilizado para lavagem de células e etapas de diluição</td></tr><tr><td>Placas de Petri (100 mm, não&amp;ndash;tratado para cultura de tecidos</td><td>Corning (ou equivalente)</td><td>430591</td><td>Utilizado para diferenciação de macrófagos por seleção por aderência</td></tr><tr><td>Tampão de lise de eritrócitos (RBC)</td><td>BioLegend (ou equivalente)</td><td>420301 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para remover glóbulos vermelhos durante o isolamento de PBMCs</td></tr><tr><td>Corante Viobility 405/452 Fixável</td><td>Miltenyi Biotec (ou equivalente)</td><td>130-130-404 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para avaliar a viabilidade celular durante a análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (ou equivalente)</td><td>D9542 (ou equivalente)</td><td>Utilizado para exclusão de células mortas em citometria de fluxo</td></tr></tbody></table>

imagiologia de time-lapse da fagocitose de células de cancro da mama triplo-negativo marcadas com proteína fluorescente verde por macrófagos mediada por anticorpos

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

A fagocitose celular dependente de anticorpos é um mecanismo fundamental pelo qual macrófagos englobam células cancerígenas opsonizadas por anticorpos. Este protocolo descreve um método de imagem em tempo real com registro contínuo para visualizar a fagocitose mediada por macrófagos dependentes de anticorpos em células de câncer de mama triplo negativo que expressam a proteína verde fluorescente marcada e CD24. Os macrófagos são derivados de células mononucleares do sangue periférico humano, diferenciados com fator estimulador de colônias de macrófagos e polarizados com interferon gama e lipopolissacarídeo para gerar um fenótipo pró-inflamatório. As células cancerígenas são opsonizadas com um anticorpo monoclonal anti-CD24 antes da cocultura com macrófagos numa proporção definida de efetor para alvo. Os eventos fagocíticos são registrados ao longo de um período de 16 h utilizando um microscópio automatizado equipado com controle ambiental para manter condições fisiológicas. A aquisição de imagens é realizada utilizando canais de contraste de fase e fluorescência, permitindo a identificação das células cancerígenas e o monitoramento de sua internalização pelos macrófagos. Imagens representativas em sequência temporal demonstram o englobamento progressivo das células cancerígenas fluorescentes ao longo do tempo. Para permitir uma avaliação quantitativa, um ensaio paralelo de ponto final é realizado sob condições idênticas de cocultura, no qual as células cancerígenas não internalizadas são removidas antes da aquisição de imagens, permitindo uma medida precisa dos eventos fagocíticos. Este método fornece uma abordagem padronizada e reprodutível para visualizar a fagocitose mediada por macrófagos impulsionada por anticorpos in vitro. Importante, a integração da imagem em tempo real com a quantificação baseada em ponto final permite uma avaliação complementar da cinética e da magnitude da fagocitose. Este protocolo auxilia na avaliação de anticorpos terapêuticos e imunoterapias contra o câncer direcionadas a macrófagos em um ambiente in vitro controlado.

A geração e polarização bem-sucedidas de macrófagos a partir de PBMCs foram confirmadas por meio da avaliação morfológica e da análise por citometria de fluxo (Figura 1). Os PBMCs isolados por centrifugação em gradiente de densidade foram cultivados em meio suplementado com M-CSF, resultando em células aderentes com morfologia característica de macrófagos no sétimo dia. Após a estimulação com IFN-γ e LPS, as células exibiram um fenótipo compatível com ativação nas condições aplicadas. A anál...

Este protocolo descreve um método de imagem celular viva com lapso de tempo para visualizar a fagocitose de células de câncer de mama triplo negativo marcadas com proteína verde fluorescente por macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico, utilizando um microscópio automatizado.

Imagiologia de Time-Lapse da Fagocitose de Células de Cancro da Mama Triplo-Negativo Marcadas com Proteína Fluorescente Verde por Macrófagos Mediada por Anticorpos

A fagocitose celular dependente de anticorpos é um mecanismo fundamental pelo qual os macrófagos engolfam células cancerígenas opsonizadas por anticorpos. Este protocolo descreve um ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Este vídeo demonstra um ensaio para monitorar eventos independentes de fagocitose de glóbulos vermelhos mediados por macrófagos. As hemácias humanas opsonizadas com imunoglobulina G (IgG) de camundongo são incubadas com macrófagos de camundongo e observadas em microscópio confocal. As hemácias são engolfadas por macrófagos por meio de uma formação de copo fagocítico e direcionadas para degradação lisossômica.

Imagem em tempo real da fagocitose de macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados por IgG

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Aqui descrevemos o modelo e a abordagem para estudar as funções dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer. Para demonstrar o papel dessas células na metástase, foi utilizado o modelo singênico (4T1) de câncer de mama em conjunto com a depleção de macrófagos alveolares com lipossomas de clodronatos.

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

A atividade fagocítica do macrófago contra as células cancerosas, especificamente as células carcinomas mamárias do camundongo 4T1, foi imagemda neste estudo. O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido e observado por meio de uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. Esta avaliação foi imagemdo usando o software de imagem para desenvolver multiponto de vídeo time-lapse.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

Imagiologia de Time-Lapse da Fagocitose de Células de Cancro da Mama Triplo-Negativo Marcadas com Proteína Fluorescente Verde por Macrófagos Mediada por Anticorpos

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