Name: Quantificação de Fluoreto em Soro, Osso e Dentes em um Modelo Murino Utilizando Difusão Facilitada por Hexametildisiloxano e Medições com Eletrodo Seletivo de Íons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar fluoreto em soro, osso e dentes de camundongos usando difusão facilitada por hexametildisiloxano e eletrodo seletivo de íons. Este método sensível permite medir com precisão a exposição e toxicidade do fluoreto em pequenas amostras biológicas.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência; Bolsas de Pesquisa no Exterior JSPS 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) e pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial dos Institutos Nacionais de Saúde; R01DE027648 (M.S.) e K02DE029531 (M.S.).

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

As medições de fluoreto foram obtidas utilizando um eletrodo seletivo a íons de fluoreto (ISE) que incorpora fluoreto de lantânio (LaF₃) como cristal semipermeável.&#8323;membrana cristalina38,39. Esta membrana forma ligações La–F altamente estáveis, o que resulta em uma forte preferência por íons fluoreto em relação a outros haletos. De acordo com a literatura eletroquímica estabelecida e as especificações do fabricante, o LaF&#8323; a membrana apresenta coeficientes de seletividade muito baixos para cloreto, indicando que os íons cloreto não produzem interferência mensurável nas condições utilizadas neste protocolo. Embora o cloreto esteja naturalmente presente nos dentes e no osso, sua atividade não influencia o potencial do eletrodo, e o sinal registrado reflete especificamente a atividade do fluoreto. O limite inferior de detecção de 0,02 ppm corresponde à concentração mínima quantificável validada pelo fabricante para o eletrodo seletivo a fluoreto Orion. Esse limite reflete a menor concentração de fluoreto na qual o eletrodo mantém uma resposta nernstiana estável e uma relação linear com a curva de calibração. Como o limite de detecção é definido pelas características da membrana do eletrodo e validado pelo fabricante, nenhuma determinação experimental adicional foi necessária para este protocolo; no entanto, em relação ao limite superior do intervalo de detecção, os autores observaram que massas de fluoreto superiores a aproximadamente 38.000&#160;ng em um 50&#160;&#181;L A armadilha de NaOH resultou em uma resposta não linear do eletrodo, indicando que a curva de calibração já não é confiável em cargas muito altas de fluoreto. Essa não linearidade provavelmente se deve ao excesso da faixa ótima de força iônica e atividade para o eletrodo nas condições experimentais dadas, e não a um limite superior inerente ao próprio ISE. Para amostras que se espera conter massas de fluoreto acima desse limite, recomenda-se aumentar o volume da armadilha de NaOH para manter as medidas dentro da faixa dinâmica linear do eletrodo.
Essa consideração deve ser levada em conta ao aplicar o protocolo em amostras com teor de flúor incomumente alto. Como a etapa de difusão consome todo o volume da amostra, medições em duplicata e experimentos de recuperação com adição de padrão não puderam ser realizados nas amostras biológicas. Para garantir a exatidão e a precisão analítica, padrões de controle de qualidade (QC) contendo concentrações conhecidas de flúor foram incluídos em cada série de medições. Esses padrões de QC foram processados e medidos da mesma forma que as amostras experimentais. Em todas as execuções, as concentrações medidas de flúor nos padrões de QC estiveram consistentemente dentro de 5% dos valores esperados. Para cada série de 10 a 20 amostras de espécimes, dois conjuntos independentes de 5 a 6 amostras de calibração foram preparados em paralelo com as amostras de espécimes, e uma curva de calibração foi registrada antes de cada sessão de medição. A faixa de calibração foi ajustada para cada execução para se aproximar das massas esperadas de flúor nas amostras de espécimes, o que dependia do tipo de espécime, da massa do material adicionado ao recipiente de difusão e do grupo de tratamento e idade do animal. Para medições de soro, os padrões de calibração correspondiam a concentrações de flúor de aproximadamente 0,06–1,20 ppm na amostra. Para medições de osso e dente, os padrões de calibração correspondiam a concentrações de flúor de aproximadamente 19–7.600 ppm na amostra.
Este protocolo fornece uma abordagem sensível e reprodutível para quantificar a massa de íon fluoreto em soro, osso e dentes, utilizando difusão facilitada por hexametildisiloxano seguida de análise por eletrodo seletivo a íons. O método capta com confiabilidade o fluoreto liberado de diversas matrizes biológicas e permite a avaliação quantitativa do acúmulo de fluoreto após exposição controlada. Resultados representativos de camundongos adolescentes e adultos demonstram diferenças claras dependentes da idade e da dose na deposição de fluoreto nos tecidos, destacando a utilidade desta abordagem para o estudo do metabolismo e da toxicocinética do fluoreto in vivo.
Uma característica fundamental deste protocolo é o uso de placas de difusão que separam fisicamente a reação de liberação de fluoreto do ambiente de captura do fluoreto. O design selado com petrolato minimiza a troca com a atmosfera e garante a captura eficiente dos íons fluoreto liberados por gotículas de hidróxido de sódio na tampa. O ácido sulfúrico saturado com HMDS fornece uma força motriz forte e constante para a liberação de fluoreto de tecidos mineralizados, incluindo estruturas altamente calcificadas como ossos e dentes. A medição subsequente por ISE, calibrada com padrões compatíveis por difusão, permite a quantificação precisa em uma ampla faixa dinâmica. Outra vantagem desta abordagem é a sua capacidade de quantificar fluoreto em amostras biológicas extremamente pequenas. Tecidos mineralizados de camundongos, particularmente incisivos mandibulares, produzem apenas 3–5 mg de cinza por dente. Métodos analíticos convencionais frequentemente exigem massas de amostra maiores ou teores mais altos de fluoreto para obter detecção confiável. Em contraste, o design baseado em difusão concentra todo o fluoreto liberado a partir do espécime inteiro em um volume pequeno e definido, permitindo a quantificação precisa mesmo em amostras minúsculas com baixa massa absoluta de fluoreto. Este recurso é particularmente valioso para estudos envolvendo animais pequenos, disponibilidade limitada de tecido ou estruturas mineralizadas microdissecadas.
Uma limitação primária deste método é o limite de detecção do eletrodo íon-seletivo (EIS) utilizado neste estudo (0,02 ppm). As amostras de soro de animais controle livres de flúor frequentemente ficaram abaixo desse limite, impedindo a quantificação de concentrações extremamente baixas de flúor. Pode ser necessário um aumento na massa ou volume da amostra adicionada à cápsula de difusão, se disponível, ou o uso de técnicas analíticas alternativas ao medir concentrações traço próximas ou abaixo do limite de detecção. Além disso, o método exige difusão durante a noite e manipulação cuidadosa de reagentes corrosivos, o que pode limitar a produtividade em estudos de alto volume. Embora o EIS permita quantificação sensível do flúor total, ele não consegue avaliar a distribuição espacial dentro dos tecidos. Abordagens complementares, como microscopia eletrônica de varredura acoplada à espectroscopia de raios X por dispersão de energia (MEV-EDS) ou emissão gama induzida por partículas (PIGE), podem ser incorporadas para visualizar e mapear a distribuição de flúor na escala micro a macro. Essas modalidades baseadas em imagem permitem a avaliação do acúmulo localizado de flúor em tecidos mineralizados ou moles, complementando assim as medições por EIS e fornecendo uma avaliação mais abrangente do conteúdo tecidual de flúor.
Vários fatores técnicos recorrentes podem influenciar a precisão e a confiabilidade da difusão e medição de fluoreto neste protocolo, e nossas observações destacam como a preparação da calibração, vedação da cuba de difusão, controle de pH, desempenho do eletrodo e manipulação das amostras moldam coletivamente a qualidade dos dados. Possíveis causas para uma curva de calibração não linear (R2 &#60; 0,99) ou leituras de amostras de tecido fora da faixa esperada incluem erros de cálculo do volume da solução estoque de NaF adicionado à cuba de difusão ou erros de pipetagem durante a preparação dos padrões de calibração. Ação recomendada: Prepare pelo menos dois conjuntos independentes de amostras de calibração para cada ensaio, de modo que um conjunto reserva esteja disponível caso uma curva de calibração caia fora da faixa esperada. Uma vedação incompleta da cuba de difusão também pode causar perda de fluoreto durante a difusão, resultando em leituras artificialmente baixas. Isso geralmente ocorre quando é aplicada quantidade insuficiente de parafina líquida na borda da tampa da cuba de difusão. Ação recomendada: Aplique uma quantidade generosa de pomada de parafina ao redor da borda da tampa da cuba de difusão e pressione firmemente para garantir uma vedação completa. Erros de pipetagem ao adicionar a solução de ácido acético ao coletor de NaOH podem deslocar o pH da amostra para fora da faixa ótima de pH 5,0, levando a uma recuperação imprecisa de fluoreto. Ação recomendada: Verifique o pH de cada amostra com papel de pH e descarte qualquer amostra que esteja fora do pH 5. As amostras de calibração também podem cair fora dos limites válidos de registro do eletrodo seletivo a fluoreto. Concentrações abaixo de 0,02 ppm estão abaixo do limite de detecção do eletrodo. Ação recomendada: Não utilize amostras de calibração contendo menos de 0,02 ppm de fluoreto. Por outro lado, amostras de calibração com concentrações excessivamente altas de fluoreto podem alterar a força iônica da solução e produzir respostas não lineares do eletrodo. Ação recomendada: No início do projeto, prepare soluções de calibração abrangendo uma ampla faixa de concentração de fluoreto para determinar a faixa de trabalho linear do eletrodo específico em uso. Se as amostras de tecido excederem essa faixa linear, reduza a massa do tecido ou aumente o volume do coletor de NaOH e ajuste o volume de ácido acético proporcionalmente para manter o pH 5. Dificuldade em obter curvas de calibração lineares na faixa de 0,02–1 ppm: uma causa comum é o envelhecimento do eletrodo. Eletrodos seletivos a fluoreto mais antigos perdem sensibilidade em concentrações muito baixas de fluoreto. Ação recomendada: Substitua o eletrodo seletivo a fluoreto. Leituras instáveis do potenciômetro (sinal flutuante ou saltos) ocorrem tipicamente quando a superfície sensora do eletrodo não está totalmente imersa na solução da amostra. Ação recomendada: Abaixe o eletrodo para que a superfície sensora fique completamente coberta pela amostra líquida.
No geral, este protocolo fornece uma abordagem robusta, baseada em calibração, para quantificar fluoreto em diversas matrizes biológicas e é especialmente adequado para estudos que investigam exposição ao fluoreto, deposição tecidual e desfechos toxicológicos em modelos murinos.

O fluoreto é um ânion que ocorre naturalmente, e o nível ideal de fluoreto é eficaz na prevenção de cáries dentárias1,2,3,4,5. Nos Estados Unidos (EUA), a fluoretação da água de abastecimento público com 0,7 ppm tem sido implementada como uma estratégia de saúde pública para reduzir a incidência de cáries e promover a saúde bucal6. No entanto, a ingestão prolongada de quantidades excessivas de fluoreto pode afetar adversamente diversos tecidos. A exposição elevada a fluoreto interrompe a formação do esmalte7,8,9, altera a formação óssea10 e compromete a integridade esquelética11.
No nível celular, a exposição ao flúor induz diversas perturbações metabólicas, incluindo estresse oxidativo12, estresse do retículo endoplasmático13, modificações epigenéticas que alteram a expressão gênica14 e apoptose em ameloblastos15,16,17,18. Globalmente, concentrações elevadas de flúor em águas subterrâneas (&#62;1,5 ppm) representam uma preocupação significativa para a saúde. Um estudo recente de modelagem preditiva estimou que aproximadamente 180 milhões de pessoas em todo o mundo podem estar afetadas pela exposição excessiva ao flúor, com a maior carga ocorrendo na Ásia e na África1. Além da água potável, a exposição ao flúor também ocorre por meio de alimentos (por exemplo, frutos do mar; ~1,9 ppm), bebidas (por exemplo, chá; 0,5–6 ppm19) e produtos odontológicos, como creme dental20 (1.000–1.500 ppm).
Portanto, compreender a exposição, o metabolismo e a deposição tecidual do flúor é essencial para avaliar tanto seus benefícios terapêuticos quanto suas possíveis consequências toxicológicas. A quantificação precisa de flúor em espécimes biológicos — incluindo urina, soro, osso e dentes — é um componente crítico desse trabalho. No entanto, a medição é analiticamente desafiadora devido ao comportamento químico do flúor e à sua forte afinidade por matrizes ricas em cálcio. Aproximadamente 99% do flúor no organismo está presente em tecidos mineralizados, como osso e dentes21. Para enfrentar esses desafios, diversas técnicas analíticas foram desenvolvidas, incluindo potenciometria com eletrodo seletivo a íons (ISE), cromatografia iônica, ensaios colorimétricos, procedimentos titrimétricos e métodos nucleares ou baseados em ativação22. Dentre essas, a técnica de difusão facilitada por hexametildisiloxano (HMDS) combinada com medição por eletrodo seletivo a flúor emergiu como uma das abordagens mais confiáveis e amplamente utilizadas para matrizes biológicas, devido à sua sensibilidade, reprodutibilidade e compatibilidade com diversos tipos de amostras23,24,25,26,27,28,29.
Apesar da disponibilidade de múltiplos métodos analíticos, cada abordagem possui limitações que podem restringir seu uso em pesquisas experimentais ou clínicas. A cromatografia iônica oferece alta sensibilidade e seletividade, mas exige instrumentação especializada e preparação extensiva das amostras30,31. Ensaios colorimétricos, como o método SPADNS (sulfonato de sódio 2-(parassulfofenilazo)-1,8-dihidroxinaftaleno-3,6-disulfônico), são simples e baratos, mas são suscetíveis à interferência da turbidez e de cromóforos endógenos, o que limita sua confiabilidade em amostras biológicas complexas22,32,33. Métodos titrimétricos são econômicos e diretos, mas carecem da sensibilidade necessária para a detecção de traços de fluoreto na maioria dos espécimes biológicos34. Técnicas nucleares ou baseadas em ativação oferecem sensibilidade excepcional, mas exigem acesso a reatores ou fontes de nêutrons baseadas em aceleradores, tornando-as impraticáveis para uso rotineiro em laboratório35. Em contraste, a difusão facilitada por HMDS seguida de medição por ISE fornece um equilíbrio prático entre sensibilidade, custo e acessibilidade, garantindo a liberação completa do fluoreto tanto de tecidos moles quanto mineralizados. Isso é particularmente vantajoso em estudos com animais pequenos, nos quais a disponibilidade de tecido é limitada e estruturas mineralizadas, como os incisivos de camundongo, produzem apenas 3–5 mg de cinza por dente.
A capacidade do método de ISE por difusão de concentrar todo o flúor liberado em um pequeno volume definido permite a quantificação precisa, mesmo em amostras extremamente pequenas. Isso torna o método particularmente adequado para estudos toxicocinéticos, experimentos de dose-resposta e investigações do metabolismo do flúor em diferentes estágios de desenvolvimento. Roedores pequenos, especialmente camundongos C57BL/6J, têm sido amplamente utilizados como modelos animais para estudar os efeitos do flúor7,9,12,29,36 .
Neste protocolo, os autores aplicam a técnica de difusão facilitada por HMDS seguida da medição com eletrodo seletivo a fluoretos para quantificar o flúor em soro, osso e dentes coletados de camundongos expostos a uma dose elevada de flúor (125 ppm) em comparação com controles não tratados. Os autores também comparam o acúmulo de flúor em camundongos adolescentes (6 semanas no início do tratamento) e maduros (18 semanas no início do tratamento) para avaliar as diferenças dependentes da idade no metabolismo e deposição tecidual do flúor. Os incisivos mandibulares foram selecionados como tecido dentário representativo porque os incisivos de roedores erupcionam continuamente e atingem um equilíbrio em estado estacionário entre erupção e desgaste oclusal por volta das 7 semanas de idade. Esse padrão de crescimento contínuo fornece um gradiente consistente e acessível de desenvolvimento do esmalte, tornando os incisivos de camundongos um modelo amplamente utilizado e bem validado para investigar a formação do esmalte e a fluorose dentária.

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético, Glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco, GR ACS</td><td>AX0073-6</td></tr><tr><td>Crucíveis de Alumina</td><td>Advalue Technology</td><td>12 mm OD &amp;times; 25 mm H, AL-6212</td><td>AL-6212</td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>VWR</td><td>VWR 124B2, d = 0,1 mg</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Batedor de Perlas</td><td>Benchmark</td><td>BeadBug 6</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Agulha de Seringa com Ponta Romba</td><td>Amazon</td><td>Agulha Industrial com Ponta Romba, 14 G &amp;times; 0,5 polegada</td><td>X001TT8KX1</td></tr><tr><td>Dióxido de Carbono</td><td>AirGas</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Capa de Exaustão Química</td><td>Mott Manufacturing</td><td>Modelo 7421040</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Sacarose D(+)</td><td>Thermo Scientific</td><td>99,7% para Bioquímica</td><td>177142500</td></tr><tr><td>Solução de Preenchimento para Eletrodo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus Filling Solution</td><td>900061</td></tr><tr><td>Solução de Álcool Etílico</td><td>Koptec</td><td>140 Provas</td><td>2401</td></tr><tr><td>Freezer, &amp;minus;80 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco Série RDE</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Luvas Resistentes ao Calor</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Clavies Luvas para Autoclavagem com Risco Biológico</td><td>H13201</td></tr><tr><td>Hexametildisiloxano (HMDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TCI H0091, &gt;98%</td><td>H0091</td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio</td><td>VWR</td><td>J.T. Baker, 30%</td><td>2204-01</td></tr><tr><td>Eletrodo Seletivo a Íons</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Fluoride ISE, Canal Duplo</td><td>9609BNWP</td></tr><tr><td>Misturador Magnético</td><td>VWR</td><td>Agitador 360</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Microespátula</td><td>Amazon</td><td>Microespátula para Modelagem em Cera #7A, Aço Inoxidável</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>5404000131</td></tr><tr><td>Fornalha Mufla</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermolyne Pequena Fornalha Mufla de Bancada, 1,3 L, FB1315M</td><td>FB1315M</td></tr><tr><td>Estufa</td><td>Boekel Scientific</td><td>Boekel RapidFISH</td><td>240200</td></tr><tr><td>Solução de Paraformaldeído em PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>4% de Paraformaldeído em PBS</td><td>J19943-K2</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>60 &amp;times; 15 mm, Não Tratada</td><td>25384-092</td></tr><tr><td>Petrolato</td><td>Thermo Scientific</td><td>Petrolato, Branco, Puro</td><td>417090010</td></tr><tr><td>Papel Indicador de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>pH-Fix 4,5&amp;ndash;10,0</td><td>92120,3</td></tr><tr><td>Recipiente de Porcelana</td><td>Fisher Scientific</td><td>Crucível Fisherbrand, 5 mL, 20 mm de Altura, Forma Alta</td><td>FB-965-B</td></tr><tr><td>Potenciômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Dual Star Medidor de pH/ISE</td><td>2115102</td></tr><tr><td>Suporte com Garras</td><td>VWR</td><td>Garra de Anel, 15 cm</td><td>470104-526</td></tr><tr><td>Dieta para Roedores</td><td>Bio-Serv</td><td>F1515, AIN-76A, &amp;frac12; Pelotas</td><td>F1515</td></tr><tr><td>Macaco de Parafuso</td><td>Amazon</td><td>Macaco de Laboratório</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Funil de Separação</td><td>Fisher Scientific</td><td>Eisco, Vidro Borossilicato, 2 L</td><td>S89285</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Certificado ACS, Cristalino</td><td>S271-1</td></tr><tr><td>Fluoreto de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Certificado ACS, Pó</td><td>S299-100</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Pelotas Brancas</td><td>BP359-500</td></tr><tr><td>Perlas de Aço Inoxidável</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Industries, 5 mm, 100 unidades</td><td>SI-CS05</td></tr><tr><td>Ácido Sulfúrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Qualidade ACS</td><td>A300-500</td></tr><tr><td>TISAB II</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus Application Solution</td><td>940909</td></tr><tr><td>Dessecador a Vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Dessecador a Vácuo Space Saver, 10 polegadas</td><td>F42010-0000</td></tr><tr><td>Filtro a Vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Filtro de Frasco com Tampa, PES, 90 mm, 0,2 &amp;micro;m</td><td>597-4520</td></tr><tr><td>Rocker Variável</td><td>MidSci</td><td>LabDoctor / Benchmark Scientific</td><td>&amp;mdash;</td></tr></tbody></table>

quantificação de fluoreto em soro, osso e dentes em um modelo murino utilizando difusão facilitada por hexametildisiloxano e medições com eletrodo seletivo de Íons

Quantification of Fluoride in Serum, Bone, and Teeth in a Murine Model Using Hexamethyldisiloxane-Facilitated Diffusion and Ion-Selective Electrode Measurements

A quantificação dos níveis de fluoreto em tecidos biológicos é essencial para compreender a exposição, o metabolismo e a toxicidade do flúor. Este protocolo descreve um método sensível e reprodutível para medir a massa de íons fluoreto em soro, osso e dentes, utilizando difusão facilitada por hexametildisiloxano (HMDS) seguida de análise por eletrodo seletivo a íons (ISE). Espécimes biológicos, incluindo soro, osso femoral e incisivos mandibulares, são coletados de camundongos expostos a tratamentos controlados de fluoreto. Os espécimes de osso e dente são calcinados, moídos e hidratados, enquanto o soro é processado diretamente. Cada espécime é transferido para uma cápsula de difusão contendo água ultrapura e selada com uma tampa revestida de petrolato, contendo gotículas de hidróxido de sódio que funcionam como armadilhas para o fluoreto. A injeção de ácido sulfúrico saturado com HMDS inicia a liberação e difusão do fluoreto, permitindo que os íons fluoreto liberados sejam capturados quantitativamente nas armadilhas. Após a difusão durante a noite, as gotículas das armadilhas de fluoreto são combinadas em uma única amostra, acidificadas para a faixa de pH requerida e ajustadas para um volume definido para medição por ISE. Cápsulas de difusão de calibração, preparadas com massas conhecidas de fluoreto, geram uma curva padrão para quantificação, e amostras de controle de qualidade verificam a estabilidade do eletrodo. Resultados representativos de camundongos adolescentes e adultos expostos a 0 ou 125 ppm de fluoreto demonstram a capacidade do método de detectar diferenças dependentes da idade e da dose nos níveis de fluoreto no soro, osso e dentes. Este protocolo fornece uma abordagem robusta, baseada em calibração, para quantificar fluoreto em diversas matrizes biológicas e é especialmente adequado para estudos que investigam exposição ao fluoreto, deposição tecidual e efeitos toxicológicos em modelos murinos. Uma vantagem fundamental deste método é sua capacidade de quantificar com precisão o fluoreto em espécimes extremamente pequenos, incluindo os 3–5 mg de cinza obtidos de incisivos individuais de camundongo, pois o processo de difusão concentra todo o fluoreto liberado em um volume mensurável inferior a 100&#160;µL.

Para demonstrar a aplicação deste protocolo na medição de concentrações de fluoreto (F-) em materiais biológicos, amostras de espécimes foram obtidas de soro, osso e incisivos mandibulares coletados de camundongos submetidos a tratamentos controlados com fluoreto. Camundongos machos C57BL/6J foram divididos em duas categorias etárias, adolescentes (6 semanas) e adultos (18 semanas), e receberam água deionizada livre de fluoreto (0 ppm F⁻) ou água de consumo suplementada com fluoreto de sódio (125 ppm F⁻) durante um período de exposição de 6 semanas. Cada grupo etário e condição de tratamento incluiu cinco animais. Ao final do período de exposição, foram coletados soro, fêmures e incisivos mandibulares, e as amostras dos espécimes foram preparadas e analisadas conforme o protocolo. As concentrações representativas de fluoreto medidas no soro, osso e dentes são resumidas abaixo.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig4.jpg" /> 
Figura 4: Concentrações de flúor medidas no soro, no osso femoral e nos incisivos mandibulares. Camundongos machos C57BL/6J foram divididos em duas categorias etárias, adolescentes (6 semanas, barra aberta) e adultos (18 semanas, barra preenchida), e receberam água deionizada livre de flúor (0 ppm F⁻) ou água de beber suplementada com fluoreto de sódio (125 ppm F⁻) durante um período de exposição de 6 semanas. Ao final do período de exposição, os níveis de flúor foram medidos em (A) soro, (B) osso femoral e (C) incisivos mandibulares dos mesmos grupos tratados. Valores séricos abaixo do limite de detecção (&#60;0,02 ppm) foram plotados para fins de visualização, mas excluídos da análise estatística. Os dados são expressos como médias ± DP. As comparações entre os grupos adolescentes e adultos foram realizadas utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/grupo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.</a>
Concentrações de flúor no soro 
Em ambos os grupos tratados com flúor a 0 ppm, as concentrações séricas de flúor estavam abaixo do limite de detecção do eletrodo seletivo a íons (&#60;0,02 ppm). Nos grupos tratados com 125 ppm, o flúor sérico aumentou para 0,3 ± 0,2 ppm no grupo adolescente e para 0,7 ± 0,2 ppm no grupo maduro (p = 0,06). A comparação entre os grupos adolescentes e maduros tratados com 125 ppm foi realizada utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/grupo). Os grupos tratados com 0 ppm foram excluídos da análise estatística. (Figura 4A, Tabela 1).
Concentrações de flúor no fêmur 
Nos grupos tratados com 0 ppm, as concentrações de flúor no fêmur foram significativamente menores em animais adolescentes (292 ± 39 ppm) em comparação com animais maduros (896 ± 55 ppm) (p &#60; 0,01). Em contraste, nos grupos tratados com 125 ppm, as concentrações de flúor em animais adolescentes (4.108 ± 482 ppm) foram significativamente maiores do que em animais maduros (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). As comparações entre os grupos adolescentes e maduros foram realizadas utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/grupo). (Figura 4B, Tabela 1). Figura 5A mostra a variação relativa nas concentrações de flúor no fêmur entre os tratamentos com 0 ppm e 125 ppm para cada grupo etário. Os animais adolescentes apresentaram um aumento de 14 vezes nos níveis de flúor a 125 ppm, enquanto os camundongos maduros exibiram um aumento de 3 vezes.
Concentrações de flúor em incisivos mandibulares 
Nos grupos com 0 ppm, as concentrações de flúor nos incisivos mandibulares foram significativamente menores em adolescentes (35 ± 4 ppm) em comparação com animais maduros (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). Nos grupos tratados com 125 ppm, as concentrações de flúor nos incisivos aumentaram para 5641 ± 955 ppm em adolescentes e 4392 ± 1694 ppm em animais maduros. As comparações entre os grupos adolescentes e maduros foram realizadas utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/grupo). (Figura 4C, Tabela 1). Embora as concentrações absolutas de flúor em 125 ppm não tenham diferido significativamente entre os grupos etários, a variação proporcional de 0 ppm para 125 ppm foi significativamente maior em camundongos adolescentes (aumento de 161 vezes) do que em camundongos maduros (aumento de 36 vezes) (Figura 5B).
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig5.jpg" /> 
Figura 5: Adolescentes apresentam um aumento maior na acumulação de flúor no osso e nos incisivos em comparação com camundongos adultos. Variação na concentração de flúor de 0 ppm para 125 ppm no tratamento com flúor em camundongos adolescentes (barras abertas) e adultos (barras preenchidas). (A) Osso femoral e (B) Incisivo mandibular dos mesmos grupos de tratamento. Os dados são expressos como média ± DP. As comparações entre os grupos adolescentes e adultos foram realizadas utilizando o teste t não pareado. * p &#60; 0,05, (N = 5/grupo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amostra</td>
			<td colspan="4">Soro</td>
			<td colspan="4">Fêmur</td>
			<td colspan="4">Incisivo Mandibular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupo Etário</td>
			<td colspan="2">Adolescente</td>
			<td colspan="2">Maduro</td>
			<td colspan="2">Adolescente</td>
			<td colspan="2">Maduro</td>
			<td colspan="2">Adolescente</td>
			<td colspan="2">Maduro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupo de Tratamento</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,2</td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,8</td>
			<td>324</td>
			<td>4576</td>
			<td>933</td>
			<td>3081</td>
			<td>37</td>
			<td>4824</td>
			<td>161</td>
			<td>3229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,1</td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,8</td>
			<td>229</td>
			<td>3778</td>
			<td>924</td>
			<td>3326</td>
			<td>39</td>
			<td>5451</td>
			<td>127</td>
			<td>2654</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,7</td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>1,0</td>
			<td>300</td>
			<td>4683</td>
			<td>877</td>
			<td>3713</td>
			<td>31</td>
			<td>5544</td>
			<td>112</td>
			<td>6997</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,4</td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,5</td>
			<td>323</td>
			<td>3832</td>
			<td>807</td>
			<td>2519</td>
			<td>35</td>
			<td>5114</td>
			<td>103</td>
			<td>4169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,3</td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,5</td>
			<td>283</td>
			<td>3669</td>
			<td>937</td>
			<td>2192</td>
			<td>N/A</td>
			<td>7271</td>
			<td>111</td>
			<td>4909</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Média</td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,3</td>
			<td>&#60; 0,02</td>
			<td>0,7</td>
			<td>292</td>
			<td>4108</td>
			<td>896</td>
			<td>2966</td>
			<td>35</td>
			<td>5641</td>
			<td>123</td>
			<td>4392</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,2</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,2</td>
			<td>39</td>
			<td>482</td>
			<td>55</td>
			<td>612</td>
			<td>3</td>
			<td>955</td>
			<td>23</td>
			<td>1694</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Medições individuais de fluoreto no soro, osso femoral e incisivos mandibulares. A Tabela 1 lista as concentrações individuais de fluoreto (ppm F⁻) medidas no soro, osso femoral e espécimes de incisivos mandibulares de camundongos adolescentes e adultos expostos a 0 ppm ou 125 ppm de fluoreto. Para cada tipo de tecido, os dados são apresentados em colunas correspondentes aos quatro grupos experimentais: adolescente 0 ppm, adolescente 125 ppm, adulto 0 ppm e adulto 125 ppm. Cada coluna inclui os cinco valores individuais registrados (N = 5), seguidos pela média calculada e desvio padrão (DP). No grupo de soro de animais adolescentes com 0 ppm, todos os valores registrados estavam abaixo do limite de detecção do eletrodo iônico seletivo (&#60;0,02 ppm). A tabela fornece os dados numéricos brutos que fundamentam os valores resumidos e comparações estatísticas apresentadas na Figura 4.

Este protocolo descreve a preparação de placas de difusão facilitada por hexametildissiloxano (HMDS), seguida por medições com eletrodo seletivo de íons para quantificar a massa de íons fluoreto no soro, osso e dentes de camundongos. O método fornece uma abordagem sensível, baseada em calibração, para avaliar o acúmulo de fluoreto em espécimes biológicos.

Quantificação de Fluoreto em Soro, Osso e Dentes em um Modelo Murino Utilizando Difusão Facilitada por Hexametildisiloxano e Medições com Eletrodo Seletivo de Íons

A quantificação dos níveis de fluoreto em tecidos biológicos é essencial para a compreensão da exposição, do metabolismo e da toxicidade do fluoreto. Este protocolo descreve um...

Nossa pesquisa concentra-se na quantificação da concentração de flúor em soro, osso e dentes de camundongos tratados com flúor. Os métodos existentes exigem amostras grandes ou instrumentos caros. Este protocolo mede o flúor em amostras de microlitros ou miligramas.Para começar, dissecar os ossos das patas de camundongos C57BL/6J adolescentes e adultos que receberam água de beber com ou sem fluoreto de sódio. Após a secagem, transferir o osso para um cadinho de alumina e calciná-lo em forno mufla a 600 graus Celsius por seis horas, utilizando uma taxa de rampa de 150 graus Celsius por hora.Coloque uma placa de Petri não tratada de 60 por 15 milímetros sobre uma superfície limpa. Usando uma agulha de seringa aquecida de 18 gauge, derreta um pequeno orifício na tampa da placa de Petri. Em seguida, com uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha romba de 14 gauge, revista o anel interno da tampa da placa de Petri com um selo contínuo de petrolato. Usando uma espátula micro, triture os ossos calcinados dentro dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro até obter um pó fino e prossiga imediatamente com o processamento da cinza óssea pulverizada. Descarte os materiais descartáveis contaminados com a cinza óssea no fluxo de resíduos químicos institucional. Transfira a cinza óssea moída para um pequeno recipiente de porcelana para minimizar a carga estática e evitar a dispersão do pó. Em seguida, coloque a base vazia da placa de Petri sobre uma balança analítica com precisão de leitura de pelo menos 0,1 miligrama. Usando uma espátula micro, adicione aproximadamente 5 miligramas da cinza óssea e registre o peso exato. Cubra imediatamente a cinza pesada com 3 mililitros de água ultrapura.Adicione 50 microlitros de hidróxido de sódio 0,05 normal, em três gotas, na superfície interna da tampa da placa de Petri, longe da borda, para formar uma armadilha de fluoreto. Inverta a tampa da placa de Petri sem perturbar as gotas de hidróxido de sódio. Sobreponha bem a tampa à base da placa de Petri com vaselina. Prepare uma solução de ácido sulfúrico saturada com HMDS 3 normal misturando volumes iguais de ácido sulfúrico saturado com HMDS 6 normal e água ultrapura. Carregue imediatamente 3 mililitros da solução preparada em uma seringa de 10 mililitros equipada com agulha de 20 calibres. Injete a solução através do orifício na tampa na água localizada na base da placa de difusão. Retire cuidadosamente a agulha sem salpicar ácido na superfície interna da tampa. Sobreponha rapidamente o orifício de injeção completamente com um filete de vaselina. Coloque as placas de difusão sobre um agitador variável ajustado em velocidade baixa e incube durante a noite à temperatura ambiente.Antes de iniciar as medições, monte o eletrodo seletivo a íons preenchido no suporte e conecte-o ao potenciômetro. Posicione uma placa de Petri não tratada sobre um elevador mecânico sob a superfície sensora do eletrodo, garantindo que a superfície sensora esteja paralela ao fundo da placa. Eleve a plataforma do elevador mecânico até que a placa de Petri esteja quase tocando o eletrodo. Após o período de incubação, remova a placa de difusão do agitador. Levante cuidadosamente a tampa rompendo o selo de parafina. Em seguida, inverta a tampa sobre uma superfície plana sem perturbar as três gotas do coletor de fluoreto. A seguir, use uma pipeta P20 para adicionar de 15 a 20 microlitros de ácido acético 0,2 normal a uma das gotas do coletor de fluoreto e una as três gotas em uma única gota sem trocar a ponteira da pipeta. Mantenha a amostra combinada sobre a tampa invertida. Ajuste uma pipeta P100 para 75 microlitros. Aspire todo o volume do coletor de fluoreto sem introduzir ar e ajuste o volume da amostra exatamente para 75 microlitros usando água ultrapura. Prossiga imediatamente com a medição. Dispense a amostra entre a superfície sensora do eletrodo seletivo a fluoreto e a placa de Petri. Certifique-se de que toda a superfície sensora esteja submersa no líquido sem tocar a placa de Petri. Aguarde a estabilização da leitura e, então, registre o potencial do eletrodo em milivolts a partir do visor do potenciômetro.Em camundongos, com água de consumo livre de flúor, a concentração efêmera de flúor foi significativamente menor nos adolescentes do que nos camundongos adultos. Em contraste, a exposição a 125 partes por milhão de flúor reverteu esse padrão, com concentrações femorais de flúor significativamente maiores nos adolescentes do que nos camundongos adultos. Após a exposição ao flúor, os camundongos adolescentes apresentaram um aumento de 14 vezes na concentração femoral de flúor, enquanto os camundongos adultos apresentaram um aumento menor, de apenas três vezes.Este protocolo mede com precisão as concentrações de flúor em soro e tecidos mineralizados em volumes de amostra muito pequenos. É fundamental que a cinza pesada com precisão seja totalmente transferida para o recipiente de difusão, pois qualquer perda compromete os resultados. Esperamos que estudos futuros utilizem esta abordagem para descobrir como o acúmulo de flúor influencia a saúde tecidual, o risco de doenças e o envelhecimento.

quantification-fluoride-serum-bone-teeth-murine-model-using

Research

JoVE Journal

Biology

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Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Aprenda a quantificar fluoreto em soro, osso e dentes de camundongos usando difusão facilitada por hexametildisiloxano e eletrodo seletivo de íons. Este método sensível permite medir com precisão a exposição e toxicidade do fluoreto em pequenas amostras biológicas.

Quantificação de Fluoreto em Soro, Osso e Dentes em um Modelo Murino Utilizando Difusão Facilitada por Hexametildisiloxano e Medições com Eletrodo Seletivo de Íons (Vídeo) | JoVE Journal

Quantificação de Fluoreto em Soro, Osso e Dentes em um Modelo Murino Utilizando Difusão Facilitada por Hexametildisiloxano e Medições com Eletrodo Seletivo de Íons

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