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<ol><li>Winden, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberous+sclerosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Tuberous sclerosis complex.</a> Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).</li>
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<li>Ilyin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracerebroventricular+lipopolysaccharide+administration+on+behavioral%2C+neurochemical%2C+and+neurogenomic+responses+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish.</a> Behav Brain Res. 493, 115676(2025).</li>
<li>Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+examination+of+the+LPS-TLR4+immune+response+through+the+analysis+of+molecular+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions.</a> Cell Commun Signal. 23, 142(2025).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm)</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (calcium chloride)</td><td>Chempur</td><td>118748703</td><td></td></tr><tr><td>Callibration Slide (1/100 mm)</td><td>Bresser</td><td>5916710</td><td></td></tr><tr><td>Capillary holder (Grip head set 4 size 0)</td><td>Fertilart Sp. z o.o</td><td>5196082001</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Chempur</td><td>115752837</td><td></td></tr><tr><td>Human IL6</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>200-06-20UG</td><td>Concentração de estoque: 10 &micro;g/mL, Concentração de trabalho: 2 pg/nL (diluído em 0,9% NaCl)</td></tr><tr><td>Injector pump FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>KCl (potassium chloride)</td><td>Chempur</td><td>117397402</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O (magnesium chloride hexahydrate)</td><td>Chempur</td><td>116120500</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>EPE 5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Leica M165 FC 1983 magnification</td><td>Leica Microsysytems</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/ light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>Chempur</td><td>117941206</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td>Concentração de estoque: 20 mg/mL (preparado em água ultrapura), Concentração de trabalho: 0,5 mg/mL (diluído em E3)</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>ZebraBox extension - Photo Motor Response EZBPMR</td><td>Animalab</td><td>https://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox</td><td>ViewPoint</td><td>https://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebrabox</td><td>Câmara de análise automatizada</td></tr></tbody></table>

microinjeção de interleucina-6 na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra do tsc para estudar comportamentos semelhantes a transtornos neuropsiquiátricos

Microinjection of Interleukin-6 into the Bloodstream of TSC Zebrafish Larvae to Study Neuropsychiatric Disorder-Like Behaviors

Microinjeção de Interleucina-6 na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra do TSC para estudar comportamentos semelhantes a transtornos neuropsiquiátricos

Patients with tuberous sclerosis complex (TSC1/TSC2 mutations) exhibit variable expressivity of autism spectrum disorder (ASD), and maternal immune ...

A minha pesquisa investiga como a inflamação induzida por IL-6 interage com mutações genéticas de risco para o autismo, influenciando o desenvolvimento e a função cerebrais. Diferentemente da inflamação ampla induzida por LPS, este protocolo eleva seletivamente a IL-6, permitindo a investigação precisa dos efeitos neurodesenvolvimentais específicos dessa citocina. Para começar, reúna as agulhas de microinjeção, os reagentes necessários e embriões de peixe-zebra com dois dias pós-fertilização.Prepare uma solução de agarose a 1% peso por volume em meio E3 e aqueça até que a agarose esteja completamente dissolvida e a solução fique transparente. Deixe a solução de agarose esfriar brevemente. Despeje aproximadamente 30 mililitros em uma placa de Petri de 100 milímetros para garantir uma camada uniforme sobre a superfície.Enquanto a agarose ainda estiver líquida, mas começando a solidificar, coloque suavemente um molde de silicone sobre a superfície para criar ranhuras uniformes. Transfira aproximadamente 100 embriões corionados com dois dias pós-fertilização para um pequeno recipiente de Petri de 50 milímetros revestido com agarose. Adicione quatro mililitros de solução de pronase recém-preparada ao recipiente, garantindo que os embriões fiquem completamente submersos.Incube à temperatura ambiente por três a cinco minutos. Sob um microscópio estereoscópico, monitore a liberação dos embriões das coriões. Gire ou agite suavemente o recipiente intermitentemente para facilitar a remoção enzimática das coriões.Continue até que a maioria dos embriões seja liberada de seus córions. Lave os embriões cuidadosamente, transferindo-os por cinco a seis trocas de meio embrionário E3 fresco. Certifique-se de que todos os córions e resíduos de pronase sejam removidos para evitar danos às larvas e manter condições ideais de cultivo.Usando uma pipeta de vidro de Pasteur, transfira aproximadamente 50 larvas descorionadas para um recipiente de Petri de 100 milímetros contendo 40 mililitros de meio E3. Mantenha as larvas no meio E3 até a microinjeção. Sob um microscópio estereoscópico, use pinças finas para quebrar cuidadosamente a ponta da capilar de vidro previamente preparada, gerando uma micropipeta com uma abertura de aproximadamente três micrômetros de diâmetro.Prepare uma solução de cloreto de sódio a 0,9% peso por volume para injeções controle. E uma solução de dois picogramas por nanolitro de Interleucina 6 ou IL-6 em cloreto de sódio a 0,9% para as injeções de IL-6. Adicione um microlitro de azul de tripano a 0,05% para cada 10 microlitros da solução de injeção para facilitar a visualização durante a injeção.Com uma pipeta, carregue a solução em uma ponteira microloader. Em seguida, use a ponteira microloader para preencher por trás a agulha de injeção micropipetada preparada com aproximadamente três microlitros da solução de injeção, garantindo que nenhuma bolha de ar seja introduzida. Fixe a agulha de injeção carregada no suporte de capilar para ser conectada ao sistema de microinjeção.Em seguida, coloque uma pequena gota de óleo mineral sobre uma lâmina de calibração. Calibre o volume de injeção expelindo gotículas no óleo mineral. Meça o diâmetro da gotícula utilizando a lâmina de calibração com escala de 0,01 milímetro.Ajuste a pressão de injeção para obter um volume de gota de aproximadamente um nanolitro. Anestesie as larvas em pequenos lotes adicionando tricaina ao meio E3 numa concentração final de 1X para minimizar o estresse e garantir uma sedação consistente. Transfira larvas individuais de dois dias pós-fertilização para uma placa de injeção com agarose solidificada.Coloque a placa sob o microscópio estereoscópico. Usando uma pipeta de vidro, oriente suavemente cada larva de modo que o ducto de Cuvier fique claramente visível e acessível. Posicione a ponta da micropipeta no ponto de entrada do ducto de Cuvier, acompanhando as células sanguíneas que se movem em direção ao coração sob o microscópio estereoscópico.Injete a primeira gota da solução preparada no ducto de Cuvier. Após aproximadamente 20 segundos, injete uma segunda gota no ducto de Cuvier. Após a injeção, transfira suavemente as larvas para uma nova placa de Petri de 100 milímetros contendo 40 mililitros de meio E3.Retorne as larvas para uma incubadora a 28,5 graus Celsius para recuperação. No dia seguinte, repita o procedimento de microinjeção conforme demonstrado anteriormente. Em cinco dias após a fertilização, utilize as larvas para aplicações posteriores, incluindo ensaios comportamentais, imageamento cerebral ou análise de imunofluorescência.A microinjeção de IL-6 não afetou a viabilidade larval em comparação com as injeções de cloreto de sódio. As taxas de sobrevivência cinco dias após a fertilização foram indistinguíveis entre os grupos injetados com IL-6 e os injetados com NACL, indicando que o regime de dosagem é bem tolerado e não introduz toxicidade inespecífica. As microinjeções reduziram ligeiramente a viabilidade em comparação com irmãos não injetados.Mutantes homozigóticos para o complexo de esclerose tuberosa 2, ou TSC2, exibiram níveis de prostaglandina E2, ou PGE2, significativamente mais altos em repouso do que irmãos selvagens. Mutantes heterozigóticos para TSC2 mostraram um aumento modesto e não significativo nos níveis basais de PGE2 em comparação com irmãos selvagens. Os níveis de PGE2 aumentaram acentuadamente em mutantes heterozigóticos para TSC2 após microinjeção de IL-6.O teste do campo aberto mostrou que mutantes TSC2 exibiram um comportamento aumentado semelhante à ansiedade em comparação com irmãos selvagens nos controles não injetados, e microinjeções de IL-6 não afetaram esse comportamento. Os mutantes TSC2 heterozigotos e homozigotos passaram significativamente mais tempo na zona externa da arena e exibiram uma exploração reduzida do centro em comparação com irmãos selvagens nos controles não injetados, bem como nas larvas TSC2 injetadas com IL-6. As injeções de IL-6 aumentaram padrões repetitivos de natação estereotipados, particularmente nos mutantes TSC2 heterozigotos.A proporção de mutantes heterozigotos TSC2 injetados com IL-6 que exibiram looping repetitivo aumentou significativamente em comparação com os controles injetados com cloreto de sódio. Este protocolo permite estudos controlados de inflamação com IL-6 para avaliar os efeitos do ambiente gênico no neurodesenvolvimento e no comportamento em peixes-zebra. Considerações importantes ao realizar este protocolo incluem tamanho consistente da agulha, volume preciso de injeção de dois nanolitros e minimização do tempo de larvas fora do meio E3. Estudos futuros podem investigar como a inflamação por IL-6 e o risco genético conjuntamente afetam o desenvolvimento cerebral e o comportamento.

microinjection-interleukin-6-into-bloodstream-tsc-zebrafish-larvae-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de...

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

O vídeo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeos (LPS) no cérebro de larvas de peixe-zebra para induzir neuroinflamação. As larvas são posicionadas em um prato forrado de agarose, a agulha é inserida nos ventrículos cerebrais e o LPS é injetado. O LPS injetado desencadeia uma resposta imune que leva à neuroinflamação.

Induzindo neuroinflamação em larvas de peixe-zebra com injeção de lipopolissacarídeo

Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e a caracterização de um modelo de zebrafish de epilepsia resultante da inibição transitória do gene DEPDC5.

Análise comportamental e fisiológica em um modelo de zebrafish de epilepsia

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences.  Para modelar como os sinais inflamatórios influenciam o neurodesenvolvimento em organismos geneticamente suscetíveis, apresentamos um protocolo para microinjeção de IL-6 no ducto de Cuvier (veia cardinal comum) das larvas de peixe-zebra, possibilitando indução controlada da inflamação e avaliação de seu impacto no desenvolvimento no contexto do complexo de esclerose tuberosa (TSC).

Microinjeção de Interleucina-6 na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra do TSC para estudar comportamentos semelhantes a transtornos neuropsiquiátricos

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