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Doenças Crônicas Não Transmissíveis - Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (nº 2023ZD0516500), Financiamento para Pesquisa Clínica de Hospitais de Alto Nível (2026-PUMCH-A-103) e Programa de Concurso Aberto da CMB (24-561) e Programa de Formação de Talentos do Hospital da Escola de Medicina da Universidade de Pequim (nº UGG11571).

Todas as amostras foram coletadas sob um protocolo aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Hospital Peking Union Medical College, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Número de Aprovação I-24PJ1778). O consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante ou de seu representante legalmente autorizado antes da coleta das amostras. O painel de patógenos-alvo e as atribuições dos poços de reação estão listados na Tabela 1, e os consumíveis utilizados durante o pré-processamento das amostras estão listados na Tabela 2.
1. Coleta de amostras clínicas do trato respiratório inferior na UTI
<ol>
	<li>Coleta de escarro
	<ol>
		<li>Enxaguar a cavidade oral com água limpa ou soro fisiológico estéril três vezes para remover resíduos alimentares e a flora oral comensal.</li>
		<li>Instruir o paciente a realizar duas a três respirações profundas, depois tossir com força para expelir escarro respiratório profundo diretamente em um copo estéril de coleta. 
		NOTA: Um espécime aceitável consiste em material viscoso, purulento ou com estrias de sangue proveniente abaixo da traqueia; saliva clara ou drenagem pós-nasal é inadequada e pode comprometer a detecção subsequente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleta de aspirado brônquico (BAS)
	<ol>
		<li>Para pacientes não entubados, inserir um cateter de aspiração estéril (um cateter de 10–12 Fr, com a fonte de aspiração ajustada a uma pressão de −0.0267 MPa, equivalente a −200 mmHg) pela via nasal ou oral até uma profundidade de aproximadamente 30 cm.</li>
		<li>Aplicar aspiração enquanto gira o cateter e retirar o cateter lentamente. Coletar as secreções aspiradas em uma armadilha estéril para espécimes. 
		NOTA: Se as secreções forem escassas, instilar aproximadamente 5 mL de soro fisiológico estéril através do cateter antes da aspiração.</li>
		<li>Para pacientes em ventilação mecânica, selecionar o cateter de aspiração de acordo com o tamanho do tubo endotraqueal: usar um cateter de 10 Fr para um tubo de 7,0–7,5 mm e um cateter de 12 Fr para um tubo de 8,0 mm.</li>
		<li>Pré-oxigenar o paciente com oxigênio a 100% por 30–60 s antes da aspiração. Desconectar o circuito do ventilador e inserir o cateter selecionado pela via aérea artificial até encontrar resistência.</li>
		<li>Aplicar uma pressão negativa de −0.0267 MPa (equivalente a −200 mmHg), limitando cada passagem de aspiração, e consequentemente o tempo de desconexão do ventilador, a não mais que 15 s para minimizar a derecrutação e hipoxemia, e reoxigenar o paciente com oxigênio a 100% por 30–60 s após a aspiração.</li>
		<li>Instilar 1–2 mL de soro fisiológico estéril através do cateter e aguardar 3 s.</li>
		<li>Aplicar aspiração e retirar o cateter. Coletar as secreções aspiradas em uma armadilha estéril para espécimes. Reconectar imediatamente o circuito do ventilador após a coleta do espécime. 
		NOTA: É essencial manter técnica asséptica rigorosa durante todo o procedimento para evitar contaminação nosocomial do espécime.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleta de lavado broncoalveolar (BALF)
	<ol>
		<li>Identificar o segmento-alvo na imagem de tórax. Avançar o broncoscópio e posicioná-lo firmemente no brônquio segmentar ou subsegmentar apropriado.</li>
		<li>Instilar alíquotas de 20–50 mL de soro fisiológico estéril rapidamente, por 3–5 alíquotas (total de 60–120 mL). Aplicar sucção suave após cada alíquota e, em seguida, coletar o fluido recuperado em um recipiente estéril e vedado. 
		ATENÇÃO: Monitoramento hemodinâmico e ventilatório contínuo é obrigatório durante o BAL em pacientes na UTI. Ajustar os parâmetros do ventilador conforme necessário para pacientes em ventilação mecânica. 
		NOTA: A recuperação típica é de 40–60% do volume instilado. Uma baixa recuperação pode exigir reposicionamento da ponta do broncoscópio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Liquefação e lise de patógenos
<ol>
	<li>Usando a pipeta descartável #2, aspire a amostra até a linha marcada (aproximadamente 1 mL) e transfira-a para o tubo de liquefação. Aperte repetidamente a bolsa da pipeta para transferir todo o material viscoso e, em seguida, tampe o tubo. 
	NOTA: Para LBA ou escarro aquoso, carregue dois volumes da pipeta para garantir entrada suficiente de patógenos.</li>
	<li>Agite vigorosamente o tubo de liquefação manualmente por 1 min. Inspecione visualmente a amostra e continue agitando até que não haja mais grumos visíveis de muco e a amostra escoe livremente pela pipeta descartável #1 sem resistência (consistência uniforme, semelhante à da água). Agite por pelo menos 1 min, prolongando o tempo conforme necessário para amostras altamente viscosas até que esses critérios sejam atendidos.</li>
	<li>Abra a tampa de vedação do tubo de lise.</li>
	<li>Aspire aproximadamente 0,5 mL da amostra homogeneizada usando a pipeta descartável #1 e transfira a amostra para o tubo de lise.</li>
	<li>Feche a tampa de vedação e verifique se a tampa da ponta está firmemente apertada.</li>
	<li>Encaixe o tubo de lise no dispositivo de pré-processamento de amostra (dispositivo SP), pressionando para baixo até que fique firme. Pressione Iniciar.</li>
	<li>Permita que o dispositivo SP conclua o ciclo automatizado de liquefação-lise (parâmetros na Tabela 3), com duração aproximada de 15 min. 
	NOTA: Não abra nem remova o tubo durante o processamento.</li>
</ol>
3. Carregamento do chip e detecção automatizada
<ol>
	<li>Carregamento de reagentes e amostras
	<ol>
		<li>Retire o chip de CD do armazenamento a 4 °C e equilibre-o à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) por 10 min. 
		&#8203;NOTA: Os frascos de reagentes O e B e o lisado pré-processado são utilizados à temperatura ambiente; a amplificação LAMP em chip é realizada a 65 °C (ver etapa 3.2.3 e Tabela 3).</li>
		<li>Abra a embalagem de folha e coloque o chip sobre uma superfície plana.</li>
		<li>Gire a tampa no sentido anti-horário para abrir o chip.</li>
		<li>Agite levemente o frasco O para recolher o líquido na parte inferior do frasco.</li>
		<li>Destampe o frasco O, insira o bico no orifício O e dispense todo o conteúdo no orifício.</li>
		<li>Descarte o frasco O. Repita o procedimento utilizando o frasco B e o orifício B.</li>
		<li>Remova o tubo de lise processado do dispositivo SP e retire a tampa da ponta.</li>
		<li>Alinhe a ponta do tubo com o orifício S e dispense todo o volume de lisado no chip.</li>
		<li>Descarte o tubo de lise usado.</li>
		<li>Rotacione a tampa do chip no sentido horário até que dois estalos audíveis confirmem o fechamento completo. 
		NOTA: O carregamento incompleto de qualquer orifício pode causar falhas em canais individuais. Confirme a dispensação completa antes de fechar. Para evitar vedação incompleta e riscos de contaminação, não use luvas de PE ao fechar a tampa; recomenda-se o uso de luvas de látex ou nitrílica.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Operação do equipamento
	<ol>
		<li>Ligue o analisador automático de ácidos nucleicos. Toque em Detectar, escaneie o código de barras na embalagem de folha do chip e insira as informações demográficas do paciente e o ID da amostra.</li>
		<li>Posicione o chip no eixo rotativo e pressione para baixo até que um estalo confirme o engate.</li>
		<li>Toque em Iniciar. O equipamento realiza autonomamente a distribuição centrífuga dos reagentes, extração com microesferas magnéticas, amplificação LAMP a 65 °C e aquisição de fluorescência. O tempo de execução é de aproximadamente 45 min (o carregamento de reagentes/amostras e o fluxo de trabalho do equipamento são resumidos na Figura 3). 
		NOTA: Não abra a tampa durante a execução.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Interpretação dos resultados
	<ol>
		<li>O software identifica o ponto de inflexão de cada curva de amplificação em forma de S por meio da análise do máximo da segunda derivada e relata o valor TP correspondente (tempo até a positividade).</li>
		<li>Compare cada valor TP com o limiar correspondente listado na Tabela 4. Classifique os canais com valores TP iguais ou inferiores ao limiar como positivos e os canais com valores TP superiores ao limiar como negativos.</li>
		<li>Verifique se o canal do controle interno (poço 16) exibe uma curva de amplificação em forma de S com valor TP inferior a 12 min.</li>
		<li>Rejeite a execução se o controle interno falhar. Repita o teste utilizando um chip novo ou colete novamente a amostra.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990&#8211;2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.</li>
	<li>Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.</li>
	<li>Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.</li>
	<li>Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.</li>
	<li>Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.</li>
	<li>Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.</li>
	<li>Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.</li>
	<li>Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.</li>
	<li>Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.</li>
	<li>Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA&#39;s diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.</li>
	<li>Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.</li>
	<li>Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.</li>
	<li>Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.</li>
	<li>Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.</li>
	<li>Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesses.

A identificação rápida de patógenos é fundamental no manejo de infecções em UTI. O sistema descrito aqui reduz o tempo para identificação do patógeno, que normalmente leva de 3 a 5 dias com o cultivo, para menos de 1 hora, um período em que as decisões sobre antimicrobianos de primeira linha frequentemente são tomadas7. Ao integrar a extração e purificação de ácidos nucleicos e a amplificação LAMP em 16 plexos em um único chip selado, este fluxo de trabalho elimina a etapa manual de extração de DNA, que tem sido o principal gargalo operacional das plataformas anteriores de chip LAMP15. O resultado é um único procedimento de carregamento que pode ser realizado por pessoal sem treinamento especializado em biologia molecular.
Vários aspectos do procedimento merecem atenção especial. A qualidade da amostra é essencial. Amostras respiratórias profundas, como aspirado brônquico ou lavado broncoalveolar, são preferíveis em relação ao escarro expetorado em pacientes ventilados, nos quais a contaminação orofaríngea pode obscurecer o sinal do patógeno verdadeiro. A liquefação incompleta é a causa mais comum de lise subótima, e a agitação manual deve, portanto, continuar até que a amostra tenha claramente atingido uma consistência aquosa. Durante o carregamento do chip, o esvaziamento incompleto do frasco do reagente ou do tubo de lise pode privar os poços subsequentes do material necessário, resultando em falhas específicas de canal que podem ser interpretadas erroneamente como resultados negativos. Além disso, o fechamento em dois cliques da tampa do chip não é apenas uma característica mecânica; é necessário para manter o espaço fechado selado exigido para a amplificação isotérmica e para prevenir perda por evaporação.
A solução de problemas é relativamente simples. O escarro viscoso de UTI pode exigir agitação manual por um tempo superior ao recomendado de 1 min. Espécimes diluídos, particularmente o lavado broncoalveolar, podem necessitar de volume de pipetagem duas vezes maior que o padrão para compensar a menor densidade de patógenos. A falha do controle interno, definida pela ausência de uma curva de amplificação em forma de S ou por um valor de TP superior a 12 min, indica celularidade insuficiente da amostra ou falha no sistema de fluidos do chip. Nesses casos, a conduta apropriada é coletar uma nova amostra ou repetir o teste utilizando um chip novo, em vez de reinterpretar canais individuais.
Este método também possui limitações importantes. O painel está restrito a 15 alvos pré-definidos, e organismos fora dessa lista, incluindo muitos determinantes de resistência a antimicrobianos, não podem ser detectados. Cada conjunto de primers tem como alvo uma região conservada e específica da espécie do organismo pretendido, exceto o ensaio em nível de gênero para Aspergillus; portanto, espécies ou cepas não representadas no painel não são detectadas, e o painel não capta a variação intraespécie em nível de cepa. Como cada um dos 16 poços contém um conjunto de primers liofilizado dedicado, o painel é modular e pode ser reconfigurado em versões futuras para incluir novos alvos.
O resultado do ensaio é qualitativo. Embora os valores de TP possam apresentar uma relação aproximada com a carga do patógeno, eles não podem substituir os resultados quantitativos de cultura ou estimativas baseadas em valores de limiar de ciclo obtidos por PCR. Como ocorre com qualquer teste de amplificação de ácido nucleico realizado em espécimes respiratórios, o ensaio por si só não pode distinguir colonização de infecção verdadeira. A interpretação clínica deve, portanto, integrar os resultados do chip com marcadores inflamatórios, como proteína C-reativa e procalcitonina, achados de imagem, biomarcadores fúngicos incluindo galactomanana e (1,3)-β-D-glicano, e o quadro clínico geral. Além disso, o sistema não fornece dados de suscetibilidade antimicrobiana, e a cultura convencional continua sendo indispensável para essa finalidade.
Por fim, todos os espécimes incluídos neste estudo foram obtidos de uma única UTI terciária, e a prevalência de patógenos e os padrões de coinfecção podem variar entre instituições e populações de pacientes. Este trabalho deve, portanto, ser considerado uma demonstração piloto e de prova de conceito do protocolo em um conjunto pequeno e deliberadamente selecionado de espécimes representativos; não foi concebido para estimar a precisão diagnóstica. A sensibilidade e especificidade clínicas por alvo, bem como a concordância sistemática com o cultivo convencional e o sequenciamento metagenômico de nova geração (mNGS), serão estabelecidas em um estudo prospectivo planejado, com inclusão consecutiva de participantes e abrangendo múltiplos centros.
Como medida inicial de desempenho analítico, o limite de detecção (LoD) para cada alvo foi estimado utilizando ácido nucleico genômico quantificado por PCR digital, adicionado a uma matriz negativa de fluido de lavagem broncoalveolar. As amostras foram diluídas em série e testadas em triplicata. O LoD foi definido como a menor concentração detectada em pelo menos 95% das réplicas. Os valores de LoD obtidos variaram de 1.000 a 4.000 cópias/mL ao longo do painel (Tabela 7). Como a quantificação baseada em contagem de colônias para cada organismo não estava disponível neste estudo piloto, essas estimativas de LoD serão refinadas em trabalhos futuros mediante o uso de cepas de referência formalmente enumeradas.
A comparação com abordagens diagnósticas existentes esclarece ainda mais a posição desta plataforma. A cultura convencional, embora lenta, continua sendo o padrão de referência e fornece informações sobre suscetibilidade. O sequenciamento metagenômico de nova geração oferece cobertura muito mais ampla de organismos, mas com custo substancialmente maior, tempos de resposta mais longos (normalmente 24–48 h) e requisitos de bioinformática que muitas UTIs não conseguem apoiar in loco9. Os painéis-padrão de PCR multiplex reduzem o tempo até o resultado, mas ainda exigem, em geral, extração separada de ácidos nucleicos e, dependendo da plataforma, processamento em lotes que pode introduzir atrasos adicionais10.
Do ponto de vista de custo, embora uma análise formal de custo-efetividade estivesse além do escopo deste estudo piloto, a plataforma aborda os principais fatores de custo no mundo real na UTI, incluindo cultura e PCR convencional ou multiplex (uma comparação qualitativa entre os métodos é fornecida na Tabela 8). Ela fornece resultados em aproximadamente 1 h, em comparação com 2–5 dias para cultura de escarro, 4–8 h para PCR convencional (que normalmente exige processamento em lote) e &#62;24 h para sequenciamento metagenômico. Como o fluxo de trabalho é totalmente integrado (entrada da amostra, saída do resultado), requer apenas uma única etapa manual de carregamento, sem necessidade de extração separada de ácidos nucleicos, pode ser realizado à beira do leito sem laboratório dedicado de bacteriologia ou biologia molecular ou pessoal especializado em biologia molecular, e utiliza um cartucho fechado e descartável que reduz testes repetidos relacionados à contaminação. Os custos com equipamentos também são modestos, eliminando a necessidade de um instrumento de PCR quantitativo em tempo real ou de uma plataforma de sequenciamento. Para pacientes gravemente doentes na UTI, esse tempo reduzido de resposta pode encurtar a duração da terapia empírica inadequada e reduzir o tempo de internação, proporcionando um benefício indireto, mas potencialmente substancial, em termos de custo.
O sistema atual ocupa um nicho distinto definido por tempo rápido de resposta, simplicidade operacional e biossegurança em cartucho fechado, características que conjuntamente tornam viável a implementação à beira do leito. A inclusão de três alvos fúngicos é uma característica particularmente importante. Aspergillus spp. foi detectado em 5 das 10 amostras (intervalo de TP: 5,5–8 min). Considerando as limitações conhecidas do cultivo e a janela diagnóstica restrita do teste de galactomanana para Aspergillus5,6, um sinal molecular disponível em menos de 45 minutos pode permitir uma consideração mais precoce de terapia antifúngica direcionada, embora o valor clínico desse sinal mais precoce precise ser estabelecido em estudos prospectivos.
Várias direções futuras são evidentes. A expansão do painel para incluir, no mínimo, os principais determinantes de resistência, como os genes de carba-penemase e o mecA, ajudaria a preencher a lacuna entre a identificação do patógeno e a seleção empírica de antimicrobianos. Além disso, à medida que os conjuntos de dados de TP crescerem, modelos de aprendizado de máquina treinados em perfis de amplificação pareados com metadados clínicos poderão eventualmente ajudar a distinguir colonização de infecção verdadeira, embora tais aplicações exijam uma cuidadosa validação prospectiva. De forma mais ampla, será necessário realizar uma avaliação multicêntrica em populações diversas de UTI para que o desempenho diagnóstico desta plataforma possa ser considerado generalizável.

Entre pacientes gravemente doentes na UTI, as infecções do trato respiratório inferior, sendo a pneumonia associada à ventilação (PAV) a principal delas, continuam sendo um fator persistente de morbidade, ventilação mecânica prolongada e mortalidade excessiva1,4. O panorama microbiológico das infecções adquiridas na UTI no trato respiratório inferior (IRTI) difere acentuadamente do observado nas doenças adquiridas na comunidade. Predominam bactérias Gram-negativas multirresistentes (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), muitas vezes em constelações polimicrobianas que dificultam os esquemas empíricos3,4. Os fungos oportunistas acrescentam uma camada adicional de complexidade. A aspergilose pulmonar invasiva, antes considerada uma característica típica de imunossupressão profunda, agora é reconhecida com frequência crescente em pacientes da UTI sem neutropenia, especialmente após gripe grave e COVID-195. Os algoritmos diagnósticos atuais para aspergilose combinam culturas de baixo rendimento com o teste de antígeno galactomanana (GM), mas o ensaio GM apresenta limitações conhecidas relacionadas às janelas diagnósticas e à sensibilidade variável em hospedeiros sem neutropenia6. Cada hora de atraso no início de uma terapia antimicrobiana adequada para sepse está associada a um aumento mensurável na mortalidade7. Em conjunto, a rapidez e a complexidade das infecções na UTI exigem ferramentas diagnósticas capazes de acompanhar a urgência clínica.
O cultivo microbiológico convencional, embora indispensável para testes de suscetibilidade, é fundamentalmente limitado em velocidade: o tempo de resposta varia de 3 a 5 dias, organismos fastidiosos são frequentemente não detectados e a positividade do cultivo fúngico permanece baixa8. O sequenciamento metagenômico de nova geração (mNGS) oferece uma alternativa imparcial, mas sua adoção clínica é limitada pelo custo, tempos de processamento de 24 a 48 horas, dependência de pipelines de bioinformática e viabilidade reduzida no ponto de atendimento9. Painéis baseados em PCR reduziram a lacuna de tempo, mas ainda exigem extração multi-etapa de ácidos nucleicos, equipamentos com ciclagem térmica e, nos formatos convencionais, eletroforese pós-amplificação10. Nenhuma dessas plataformas atende plenamente às demandas convergentes da UTI: velocidade inferior a uma hora, tempo mínimo de manipulação manual, cobertura multiplex de patógenos incluindo fungos e simplicidade operacional suficiente para pessoal não especializado em laboratório.
A amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) aborda várias dessas limitações. Primeiramente descrita por Notomi et al., o método amplifica o DNA alvo a uma temperatura constante de 65 °C utilizando um conjunto de quatro a seis iniciadores que reconhecem seis regiões distintas, impulsionado por uma polimerase deslocadora de fita11. A reação gera estruturas características de amplicons em formato de alça e semelhantes a couve-flor, detectáveis por fluorescência em tempo real, produzindo curvas em forma de S logo após a ultrapassagem do limiar. A sensibilidade em baixas concentrações de molde é alta, e o desenho com múltiplos iniciadores confere seletividade que limita resultados falsos positivos12,13. Quando combinada com plataformas de chips microfluídicos, a LAMP pode ser paralelizada para múltiplos alvos a partir de uma única carga de espécime14. Trabalhos anteriores demonstraram que sistemas de chip LAMP detectam patógenos respiratórios com tempo de resposta bem inferior a três horas15. Uma limitação importante desses sistemas, no entanto, é a dependência de extração manual separada de DNA, o que aumenta o tempo, a complexidade operacional e o risco de contaminação.
O sistema descrito aqui elimina esse gargalo. Baseado em um chip microfluídico descartável com formato de disco (86 mm de diâmetro), ele integra o carregamento da amostra, purificação de ácidos nucleicos com base em microesferas magnéticas e amplificação LAMP em 16 plex em um único cartucho selado (Figura 1). O operador realiza apenas uma breve etapa manual de liquefação-lise utilizando um tubo de processamento projetado especificamente para isso, e então carrega o lisado e dois frascos de reagentes no chip (Figura 2). A partir desse momento, o instrumento realiza de forma autônoma a extração, a amplificação isotérmica a 65 °C e a aquisição de fluorescência, fornecendo resultados qualitativos para 15 alvos clinicamente relevantes, a saber: 11 bactérias, 3 fungos (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) e 1 patógeno atípico (Mycoplasma pneumoniae), em 45 minutos. Um gene da família do ponto de quebra de neuroblastoma (NBPF), utilizado como controle interno, valida a adequação da amostra e a integridade da reação em cada ensaio. Este protocolo fornece instruções passo a passo para todo o fluxo de trabalho, desde a coleta da amostra na UTI até o pré-processamento, carregamento do chip, detecção automatizada e interpretação dos resultados, destinado tanto a profissionais de laboratório clínico quanto às equipes de atendimento à beira do leito na UTI.

<table><tbody><tr><td>Analisador Automatizado de Ácidos Nucléicos</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>THE-T80-01</td><td>TurboFlow T; realiza distribuição centrífuga de reagentes, extração com microesferas magnéticas, LAMP a 65 &amp;deg;C e detecção em tempo real de fluorescência (~45 min de execução)</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur descartável #1</td><td>Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)</td><td>Custom-made</td><td>Material descartável; 0,5 mL; transfere espécime homogeneizado para tubo de lise</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur descartável #2</td><td>Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)</td><td>Custom-made</td><td>Material descartável; 2 mL; aspira espécime até a linha marcada no tubo de liquefação</td></tr><tr><td>Chip de CD</td><td>Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd</td><td>Custom-made</td><td>Material descartável; disco de 86 mm com zona central de carregamento (portas O, B, S), zona de purificação com microesferas magnéticas e anel externo com 16 poços de reação (15 alvos patogênicos + controle interno NBPF)</td></tr><tr><td>Reagentes para reação LAMP</td><td>Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>16730ES80</td><td>Reagentes para reação LAMP pré-armazenados no chip de CD na forma de microesferas liofilizadas</td></tr><tr><td>Tubo de liquefação</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>Custom-made</td><td>Material descartável; 2 mL/tubo; recebe espécime para homogeneização manual</td></tr><tr><td>Tubo de lise</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>Custom-made</td><td>Material descartável; 0,5 mL/tubo; corpo compressível de silicone com membrana de filtro de 200 &amp;micro;m; reagentes de lise pré-carregados</td></tr><tr><td>Primeres</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td><td>Custom-made</td><td>Mistura de primeres embutida na câmara de reação do chip de CD</td></tr><tr><td>Dispositivo de Pré-processamento de Amostras</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>THE-R10-02</td><td>TS-2000; ciclo automatizado de liquefação&amp;ndash;lise (~15 min)</td></tr><tr><td>Frasco de dose única &amp;ldquo;B&amp;rdquo;</td><td>Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd</td><td>Custom-made</td><td>Material descartável; reagente pré-embalado no chip; um por teste; armazenado a 4 &amp;deg;C e equilibrado à temperatura ambiente (~25 &amp;deg;C) antes do carregamento</td></tr><tr><td>Frasco de dose única &amp;ldquo;O&amp;rdquo;</td><td>Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd</td><td>Custom-made</td><td>Material descartável; reagente pré-embalado no chip; um por teste; armazenado a 4 &amp;deg;C e equilibrado à temperatura ambiente (~25 &amp;deg;C) antes do carregamento</td></tr></tbody></table>

detecção rápida no ponto de atendimento de patógenos para infecções do trato respiratório inferior em pacientes de uti

Rapid Point-of-Care Detection of Pathogens for Lower Respiratory Tract Infections in ICU Patients

As infecções do trato respiratório inferior (ITRI) estão entre as principais causas de deterioração clínica e morte em pacientes gravemente enfermos. Na unidade de terapia intensiva (UTI), a identificação rápida do patógeno causador é essencial para uma terapia antimicrobiana adequada; no entanto, os métodos convencionais de cultura levam de 3 a 5 dias e apresentam taxas de positividade subótimas, particularmente para fungos. Abordagens moleculares, como a PCR, reduzem o tempo de análise, mas ainda dependem da extração manual de ácidos nucleicos e do termociclamento, limitando sua adequação para uso à beira do leito. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para diagnóstico pontual baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, com formato de disco (chip em CD), que combina a purificação de ácidos nucleicos com esferas magnéticas à amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP). Após uma etapa simplificada de liquefação e lise manual, a amostra processada é carregada no chip junto com dois frascos de reagentes pré-embalados. O instrumento então realiza autonomamente a extração, a amplificação a 65 °C e a leitura em tempo real da fluorescência, fornecendo resultados qualitativos para 15 alvos, nomeadamente 11 bactérias, 3 fungos e 1 patógeno atípico, em 45 minutos de tempo de execução do instrumento (aproximadamente 1 hora para o fluxo completo de trabalho de amostra à resposta, incluindo a etapa manual de pré-processamento). Apresentamos dados de detecção de 10 amostras da UTI, incluindo escarro, aspirados brônquicos e lavado broncoalveolar, abrangendo tanto infecções por um único patógeno quanto coinfecções polimicrobianas envolvendo até 7 organismos em um único chip. O design fechado da cartela minimiza o risco de contaminação por aerossóis, e a única etapa de carregamento não exige treinamento especializado, posicionando este sistema como uma ferramenta diagnóstica prática para uso à beira do leito pelas equipes da UTI.

Este protocolo descreve um método LAMP baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, que permite a detecção na assistência médica de 15 patógenos causadores de infecções do trato respiratório inferior em pacientes de terapia intensiva dentro de uma hora.

Detecção Rápida no Ponto de Atendimento de Patógenos para Infecções do Trato Respiratório Inferior em Pacientes de UTI

As infecções do trato respiratório inferior (ITRI) estão entre as principais causas de deterioração clínica e óbito em pacientes criticamente enfermos. Na unidade de terapia intensiva...

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Demonstração de um ensaio rápido quantitativa da inibição da coagulação do sangue pelo baixo peso molecular, heparina, enoxaparina. A contribuição de enoxaparina é avaliada através da remoção de sua influência através da digestão com heparinase. Uma descrição mais completa do ensaio está detalhado em nosso trabalho publicado.

Ensaio de Point-of-Care rápida de eficácia anticoagulante enoxaparina em sangue total

Um protocolo para medir leucócitos sanguíneos periféricos usando um analisador de leucócitos baseado em cartão POCT é apresentado aqui. As mesmas amostras de sangue foram testadas por dois analisadores automatizados de hematologia para avaliar a consistência e a precisão dos resultados. Os resultados mostraram que o analisador avaliado apresentou uma boa correlação com o sistema de referência.

Avaliação de um analisador de teste de ponto de cuidado para medir leucócitos sanguíneos periféricos

Tradicionalmente, a trombose venosa profunda (TVP) dos membros inferiores é diagnosticada por ultrassonografia duplex venosa realizada por radiologia. Profissionais adequadamente treinados em ultrassonografia focada no local de atendimento (POCUS) podem realizar um exame rápido à beira do leito com alta sensibilidade e especificidade em pacientes críticos. Descrevemos a técnica de varredura para o exame focado dos membros inferiores da TVP POCUS.

Triagem ultrassonográfica no local de atendimento para trombose venosa profunda proximal dos membros inferiores

A ultrassonografia point-of-care (POCUS) é uma ferramenta simples, não invasiva e portátil que permite a avaliação dinâmica das vias aéreas. Vários estudos têm tentado determinar o papel dos parâmetros ultrassonográficos como adjuvantes do exame clínico na predição de laringoscopias difíceis.

Ultrassom Point-of-Care: Uma Revisão dos Parâmetros Ultrassonográficos para Predição de Vias Aéreas Difíceis

O ultrassom point-of-care (POCUS) dos pulmões fornece respostas rápidas em cenários clínicos em rápida mudança. Apresentamos um protocolo eficiente e informativo para aquisição de imagens para uso em ambientes de cuidados agudos.

Ultrassonografia pulmonar point-of-care em adultos: aquisição de imagens

A ultrassonografia no local de atendimento (POCUS) do diâmetro da bainha do nervo óptico (ONSD) demonstrou ser útil na identificação de pacientes com pressão intracraniana (PIC) aumentada. No entanto, a técnica não padronizada para este POCUS tem dificultado seu uso. Apresentamos um protocolo padronizado de aquisição de imagens para uso no ambiente de cuidados agudos.

Ultrassom Point of Care da bainha do nervo óptico: aquisição de imagem

A espessura e a função do diafragma podem ser avaliadas em indivíduos saudáveis e pacientes críticos por meio da ultrassonografia point-of-care. Esta técnica oferece um método preciso, reprodutível, factível e bem tolerado para avaliar a estrutura e função do diafragma.

Medindo a espessura e a função do diafragma usando ultrassom no ponto de atendimento

Este protocolo revisa os passos para obter imagens da aorta abdominal com ultrassonografia point-of-care. Discutimos a aquisição de imagens, a solução de problemas de armadilhas e artefatos de imagem e o reconhecimento de patologia da aorta abdominal com risco de vida.

Uma Abordagem na Avaliação Ultrassonográfica da Aorta Abdominal

Este protocolo introduz dois métodos para aquisição de imagens em ultrassonografia gástrica. Além disso, são fornecidas dicas para interpretar essas informações para auxiliar na tomada de decisão médica.

Ultrassonografia gástrica em adultos: aquisição e interpretação de imagens

A ultrassonografia no local de atendimento (POCUS) do sistema renal e geniturinário (GU-renal) pode ajudar a rastrear certas causas de disfunção renal. No entanto, apesar de sua utilidade clínica, o POCUS renal-GU permanece subutilizado devido à falta de treinamento entre os médicos. Para resolver essa lacuna, este artigo descreve a aquisição e interpretação de imagens de GU renal.

Ultrassonografia renal e geniturinária no local de atendimento em adultos: aquisição de imagens

Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College.  This protocol describes a fully integrated microfluidic chip-based LAMP method enabling point-of-care detection of 15 pathogens causing lower respiratory tract infections in ICU patients within one hour.

Detecção Rápida no Ponto de Atendimento de Patógenos para Infecções do Trato Respiratório Inferior em Pacientes de UTI

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