Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS): Uma ferramenta de código aberto e fácil de usar para análise quantitativa de morfologia da microglia

O software de mapeamento de parâmetros microgliais, ou MMPS, nos permite estudar como a ferroptose altera as subpopulações microgliais após o acidente vascular cerebral isquêmico. O MMPS aborda gargalos-chave no campo da análise microglial, contornando requisitos de software complicados e conhecimento de codificação necessário. Para começar, abra o repositório do GitHub no computador e baixe o pacote standalone do Mapping Microglial Parameters Software ou MMPS.

Na pasta de downloads, clique duas vezes para abrir o utilitário de arquivo e extrair automaticamente a pasta compactada. Clique duas vezes no ícone do aplicativo MMPS extraído para verificar e abrir o pacote MMPS. Clique em selecionar a opção de pasta de imagem e navegue pelo diretório do computador para localizar os arquivos do projeto.

Conceda permissões de acesso à pasta e escolha o diretório de armazenamento de imagem. Em seguida, clique em selecionar pasta de saída e, então, escolha o diretório de saída. Selecione a imagem a ser processada e, em seguida, escolha a rotulagem da imagem.

Atribua identificadores de animais e grupos de tratamento à imagem e salve as entradas. Para calcular o tamanho dos pixels da imagem, selecione calibrar da barra de escala. Selecione os pontos de início e fim da barra de escala e insira a distância conhecida da barra de escala em micrometros e clique em aplicar.

Selecione o canal de fluorescência contendo o sinal microglial. Selecione as imagens para processamento marcando a caixa ao lado do nome de cada imagem e processe-as individualmente se a fluorescência de fundo for diferente entre as imagens. Revise as abas original, prévia, processada e máscaras para comparar os estágios de processamento de imagem.

Selecione prévia da imagem atual para ajustar configurações de processamento adicionais. Para subtração de fundo, defina o valor da bola rolante entre cinco e 150 pixels. Para reduzir artefatos de iluminação, use um valor de redução de ruído de três e defina os valores de nitidez entre um e dois para melhorar a definição das bordas.

Após a otimização das configurações de processamento de imagem, clique em processar imagens selecionadas. Em seguida, selecione escolher somas, todas as imagens. Clique em mostrar cor C para a visualização composta RGB.

Selecione os canais, em seguida, desmarque quaisquer canais não utilizados se a imagem parecer distorcida na cor. Clique em ajustes de exibição para ajustar o brilho do canal na visualização RGB. Selecione somas microgliais exibindo molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizado e molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizado, ou colocalização IBA1.

Remova o soma incorretamente selecionado usando a tecla de retrocesso ou apagar. Pressione enter ou return para prosseguir para a próxima imagem. Selecione contornar somas todas após a seleção do soma estar completa.

Contorne o perímetro do soma de cada célula microglial selecionada com pelo menos oito pontos de contorno, excluindo os processos celulares. Remova pontos de contorno mal posicionados usando desfazer último ponto, apagar ou retrocesso. Pressione enter, return, clique duas vezes ou clique com o botão direito para finalizar cada contorno do soma.

Clique em gerar todas as máscaras após a conclusão do contorno do soma. Nas configurações de geração de máscara, ajuste a intensidade mínima para reduzir os pixels de fundo e equilibrar a supressão do fundo e a preservação de ramificações. Selecione QA todas as máscaras para iniciar a garantia de qualidade da máscara e revise todas as máscaras apresentadas das maiores para as menores áreas.

Compare cada máscara com a microglia correspondente usando as abas processada e máscara. Para aceitar as máscaras, use o atalho de teclado A. Para rejeitar as máscaras, use o atalho de teclado R.

Para desfazer uma aceitação ou rejeição, pressione B. Use as teclas de seta do teclado para navegar pelas máscaras de tamanho. Selecione a maior máscara aceitável que captura com precisão a ramificação microglial sem incluir células vizinhas, fundo excessivo, bordas de imagem ou barras de escala. Se a maioria for imprecisa, use a opção limpar todas as máscaras para regenerar as máscaras com um valor de limiar diferente.

Em seguida, selecione calcular características simples para calcular vários parâmetros para as máscaras aceitas e, em seguida, clique em ok. Para análise adicional, baixe os plugins fractalanalysisimagej. py, sholl. py e skeletonanalysisimagej. py. Para análises fratais e de casco, abra e execute fractalanalysisimagej. py como um plugin do Fiji. Em seguida, insira o local do diretório de saída. Insira o tamanho dos pixels e selecione a opção apenas a máscara maior para analisar a maior máscara aceita por célula.

Para análise de Sholl, abra sholl. py como um plugin do Fiji. Insira o local do diretório de saída, tamanho de pixel desejado e tamanho do passo. Selecione usar o raio do soma como raio inicial ou insira um valor fixo de raio do soma se os raios do soma derivados do MMPS não forem usados. Abra skeletonanalysisimagej. py como um plugin do Fiji para análise do esqueleto.

Navegue e insira os caminhos para o diretório de máscaras, diretório de saída e tamanho dos pixels quando solicitado. Ao terminar, exporte todos os resultados gerados pelo plugin como arquivos de valores separados por vírgulas para os diretórios de saída específicos. Um estudo de validação do MMPS usando um modelo de neuroinflamação em roedores induzido por lipopolissacarídeo ou LPS mostrou que a administração de LPS diminuiu significativamente a distância média do centroide e o perímetro celular em comparação com os controles tratados com veículo.

Nenhuma diferença significativa foi observada na área da máscara, redondeza ou excentricidade entre os grupos de tratamento. A área do soma foi significativamente aumentada em animais tratados com LPS em comparação com os controles do veículo, consistente com a remodelação morfológica associada à ativação das células gliais. Ainda mais a jusante, análises morfológicas avançadas demonstraram apenas uma fraca correlação entre a redondeza e o perímetro das microglias em ratos tratados com veículo e uma forte correlação em ratos tratados com LPS, sugerindo a associação de aumento da ativação microglial com redução da redondeza e do perímetro.

Além disso, a área da máscara demonstrou fortes correlações positivas com a distância média do centroide em ambos os grupos tratados com veículo e LPS, consistente com mudanças na ramificação ligadas à ativação das microglias. Este protocolo permite que os pesquisadores estudem a ramificação microglial intrincada, homogeneidade morfológica e complexidade estrutural. Obter imagens imunofluorescentes de alta resolução é crítico para usar com precisão o MMPS.

Estudos futuros podem utilizar o MMPS para estudar como os inibidores da ferroptose alteram a morfologia das microglias após diferentes doenças do sistema nervoso, como o acidente vascular cerebral.