Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS): Uma ferramenta de código aberto e fácil de usar para análise quantitativa de morfologia da microglia

O mapeamento do software de parâmetros microgliais, ou MMPS, nos permite estudar como a ferroptose altera subpopulações microgliais após um AVC isquêmico. O MMPS aborda gargalos importantes no campo da análise microglial, contornando requisitos complexos de software e conhecimentos de programação necessários. Para começar, abra o repositório GitHub no computador e baixe o software de Mapeamento de Parâmetros Gliais ou o pacote independente MMPS.

Na pasta de downloads, clique duas vezes para abrir a ferramenta de arquivo e extrair automaticamente a pasta comprimida. Clique duas vezes no ícone extraído do aplicativo MMPS para verificar e abrir o pacote MMPS. Clique na opção selecionar a pasta de imagens e navegue pelo diretório do computador para localizar os arquivos do projeto.

Conceda permissões de acesso à pasta e escolha o diretório de armazenamento de imagens. Em seguida, clique em selecionar pasta de saída e depois selecione o diretório de saída. Selecione a imagem a ser processada e, em seguida, escolha a rotulagem da imagem.

Atribua identificadores de animais e grupos de tratamento à imagem e salve as entradas. Para calcular o tamanho do pixel da imagem, selecione calibrar na barra de escala. Selecione os pontos de início e fim da barra de escala, insira a distância conhecida da barra de escala em micrômetros e clique em aplicar.

Selecione o canal de fluorescência que contém o sinal microglial. Selecione imagens para processamento marcando a caixa ao lado de cada nome de imagem e processe-as individualmente se a fluorescência de fundo variar entre as imagens. Revise as abas original, prévia, processado e máscaras para comparar as etapas de processamento de imagem.

Selecione a imagem atual de pré-visualização para ajustar configurações adicionais de processamento. Para subtração de fundo, defina o valor da bola rolante entre cinco e 150 pixels. Para reduzir artefatos de iluminação, use um valor de redução de ruído de três e ajuste os valores de nitidez entre um e dois para melhorar a definição das bordas.

Após otimizar as configurações de processamento de imagem, clique em imagens selecionadas pelo processo. Em seguida, selecione pick somas, todas as imagens. Clique em mostrar cor C para visualização composta RGB.

Selecione canais e depois desmarque quaisquer canais não utilizados se a imagem parecer distorcida em cor. Clique em ajustes de tela para ajustar o brilho do canal na visualização RGB. Selecione microglia somas exibindo DAPI e molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada um, ou colocalização IBA1.

Remova o soma selecionado incorretamente usando a tecla de backspace ou delete. Pressione enter ou retorno para prosseguir para a próxima imagem. Selecione o esboço dos somas após a seleção do SOMA estar concluída.

Delinee o perímetro soma de cada célula microgliática selecionada com pelo menos oito pontos de contorno, excluindo os processos celulares. Remova pontos de contorno colocados incorretamente usando desfazer o último ponto, excluir ou fazer backspace. Pressione enter, retorno, duplo clique ou clique direito para finalizar cada contorno do Soma.

Clique em gerar todas as máscaras após concluir o esboço do SOMA. Nas configurações de geração de máscaras, ajuste a intensidade mínima para reduzir pixels de fundo e equilibrar a supressão de fundo e a preservação de ramos. Selecione o controle de qualidade de todas as máscaras para iniciar a garantia de qualidade das máscaras e revise todas as máscaras apresentadas das maiores às menores.

Compare cada máscara com a microglia correspondente usando as abas processadas e de máscara. Para aceitar máscaras, use o atalho de teclado A. Para rejeitar máscaras, use o atalho de teclado R.

Para desfazer uma aceitação ou rejeição, pressione B. Use as setas do teclado para navegar entre os tamanhos das máscaras. Selecione a maior máscara aceitável que capture com precisão a ramificação microglial sem incluir células vizinhas, fundo excessivo, bordas de imagem ou barras de escala. Se a maioria estiver imprecisa, use a opção de limpar todas as máscaras para regenerar as máscaras com um valor de limiar diferente.

Em seguida, selecione calcular características simples para calcular vários parâmetros para máscaras aceitas, e clique em ok. Para análise adicional, baixe fractalanalysisimagej. Py, sholl.

py, e análise esqueleta, imagem. Plugins PY. Para análises fractais e de invólucro, abra e execute a imagem fractal.

py como plugin de Fiji. Depois, insira a localização do diretório de saída. Insira o tamanho do pixel e selecione a maior opção apenas de máscara para analisar a maior máscara aceita por célula.

Para análise de sholl, open sholl. py como plugin de Fiji. Insira a localização do diretório de saída, tamanho desejado do pixel, tamanho do passo.

Selecione usar raio soma como raio inicial, ou insira um valor fixo de raio soma se raios soma derivados de MMPS não forem usados. Imagem aberta de análise esqueletoj. py como plugin de Fiji para análise de esqueletos.

Navegue e insira os caminhos do diretório de máscaras, diretório de saída e tamanho de pixels quando solicitado. Ao finalizar, exporte todos os resultados gerados por plugins como arquivos de valores separados por vírgulas para os diretórios de saída específicos. O estudo de validação do MMPS usando um modelo de neuroinflamação de roedores induzido por lipopolissacarídeos ou LPS mostrou que a administração de LPS diminuiu significativamente a distância média do centroide e o perímetro celular em comparação com os controles tratados com veículo.

Não foram observadas diferenças significativas na área da máscara, arredondamento ou excentricidade entre os grupos de tratamento. A área do soma foi significativamente aumentada em animais tratados com LPS em comparação com os controles veiculares, consistentes com a remodelação morfológica associada à ativação das células gliais. Mais adiante, análises morfológicas avançadas demonstraram apenas uma correlação fraca entre a arredondamento e o perímetro da microglia em ratos tratados com veículos, e uma forte correlação em ratos tratados com LPS, sugerindo a associação do aumento da ativação microglial com a redução da arredondamento e do perímetro.

Além disso, a área da máscara apresentou fortes correlações positivas com a distância média do centroide tanto em grupos veiculares quanto tratados com LPS, consistentes com mudanças na ramificação ligadas à ativação microglial. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem ramificações microgliais intrincadas, homogeneidade morfológica e complexidade estrutural. Obter imagens imunofluorescentes de alta resolução é fundamental para usar o MMPS com precisão.

Estudos futuros podem utilizar o MMPS para estudar como inibidores ferroptóticos alteram a morfologia microglial após diferentes doenças do sistema nervoso, como o AVC.