Construção e Implantação de um Sistema de Microinfusion para entrega Sustentada de Agentes neuroativos.

Olá, meu nome é Miles Cunningham. Juntamente com Ryan O'Connor e Sydney Wong, demonstraremos a construção de um sistema de microinfusão para administração contínua de agentes neuroativos. Este trabalho foi realizado no laboratório de neuroreconstrução do McLean Hospital, da Harvard Medical School.

Gostaríamos de agradecer à Fundação Sydney rbe e ao Narsad pelo apoio generoso. Descobrimos que agentes neuroativos podem ser administrados de forma confiável em sítios cerebrais discretos por meio de uma micro cânula de vidro de borossilicato puxada, com diâmetro da ponta cinco a dez vezes menor do que o das cânulas de administração convencionais. Neste slide, mostramos uma cânula de infusão de aço inoxidável comumente utilizada ao lado de uma micro cânula que fabricamos neste laboratório.

Essa redução no tamanho da cânula de administração resulta em uma redução drástica no trauma à região cerebral em estudo. Muitos métodos convencionais, na prática, produzem uma lesão na área de interesse ou dentro dela, tornando questionável a validade de qualquer resultado. Pode-se observar aqui, no painel A, o grau de perturbação na área local causado por uma cânula de 0,32 milímetro em comparação com uma cânula de 50 mícrons no painel B. Essas imagens em baixa ampliação são de cortes úmidos não corados de seções Vibram.

Essas mesmas seções foram então coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e imagiadas com aumento maior. Para ilustrar ainda mais a redução no dano tecidual com a micro cânula, os componentes do sistema de microinfusão são uma bomba osmótica Zet Mini com seu modulador de fluxo de aço inoxidável, do qual a aba foi removida. Dois a três centímetros de tubo de polietileno, uma micro cânula de silicato BOA personalizada e um fio guia de calibre 28, e este é o sistema de microinfusão montado, pronto para implantação.

Um polar vertical padrão para pipeta é utilizado aqui para criar microcânulas com as especificações desejadas. Polares horizontais também são adequados. O tubo de borossilicato é posicionado e fixado mediante a variação da temperatura do elemento aquecedor e da tensão do polar.

Você pode reproduzir com confiança microcânulas com diâmetros específicos e hastes longas com afunilamento progressivo. O tubo de sílica Bora é aquecido e é aplicada pressão suave para reduzir a quantidade desejada de curvatura no tubo. Essa curvatura é feita a uma distância da ponta da microcânula apropriada para a profundidade do alvo cerebral de interesse e que permite folga acima do crânio.

O comprimento final deste tubo distal da microcânula, a curvatura tem aproximadamente nove a 10 milímetros. Aparentemente insatisfeito com seu resultado, Ryan reinsere a microcânula para fazer um ajuste fino, aperfeiçoando o ângulo da curvatura ali.

Isso é muito melhor usando um lápis de diamante. Sydney demonstra um método para cortar o tubo de borossilicato aproximadamente cinco milímetros proximal à curvatura, segurando firmemente o tubo sobre uma superfície dura com a porção distal da microcânula livre para pendurar sobre a borda. Ela faz um corte ao redor do tubo.

Em seguida, aplicando pressão suave, ela quebra o tubo limpidamente na interface marcada. A fina ponta transparente da cânula pode então ser colorida com tinta permanente para facilitar a visualização. Durante a cirurgia com ampliação, a ponta da cânula microcirúrgica é cortada com tesoura de microdissecção até o diâmetro desejado.

O diâmetro da ponta pode ser confirmado com uma lente ocular ou um microscópio. Fios para alinhamento radical são preparados a partir de fio de aço inoxidável de calibre 28, cortado em comprimentos de aproximadamente três centímetros. Em seguida, pinças são usadas para criar um pequeno gancho na extremidade de cada fio, com cerca de dois milímetros de diâmetro.

Os fios de alinhamento são colocados em uma placa de Petri junto com comprimentos de dois a três centímetros de tubo de polietileno nas microcânulas. O sistema de microinfusão pode ser montado com instrumentos comuns à maioria dos laboratórios. Pinças microcirúrgicas, pinças convencionais, tesouras cirúrgicas e hemostáticos são colocados em um campo cirúrgico para esterilização.

Os instrumentos, os componentes do sistema de microinfusão, bem como várias folhas de papel alumínio são esterilizados utilizando uma autoclave padrão. O modulador de fluxo é cuidadosamente removido da sua embalagem e colocado em uma placa de Petri estéril. É mantido firmemente com hemostatos e a aba de plástico é removida do tubo metálico do modulador com uma tesoura.

A bomba osmótica miniatura também é removida de sua embalagem e colocada em uma placa de Petri estéril. O tubo de aço inoxidável é inserido no tubo de polietileno cerca de dois a três milímetros, e os dois são selados juntos usando epóxi ativado por luz. Utilizamos Lummi bond do meu laboratório neural para trabalhos delicados; preenchemos uma seringa de um CC com Lummi bond e usamos uma agulha de 27 gauge como aplicador sob luz intensa, sendo que o Lumon endurece em apenas alguns segundos.

A bomba osmótica miniatura é preenchida mantendo-a em posição vertical e injetando cuidadosamente o fluido com a agulha de preenchimento fornecida pelo fabricante. Recomendamos observar o volume do fluido injetado na bomba ou pesar a bomba antes e depois do preenchimento para garantir que ela esteja completamente cheia e não apresente defeitos. Observe que não recomendamos reutilizar bombas.

O modulador completo, com seu tubo de polietileno acoplado, é então inserido dentro da bomba osmótica miniatura. O fluido dentro da bomba será forçado para dentro do tubo de polietileno à medida que o modulador de espuma for inserido. A distância inicial do tubo de polietileno preenchido com o fluido é anotada e deve ser observada aumentando após a ativação da bomba mediante incubação com solução salina estéril a 39 graus Celsius por 12 horas de incubação.

A bomba osmótica mini ativada é submersa em solução salina estéril, o que fornece um ambiente livre de ar para as etapas finais na construção do sistema de microinfusão. Uma seringa equipada com tubo plástico de pequeno calibre e preenchida com a mesma solução contida na bomba é usada para deslocar o ar da porção vazia do tubo de polietileno. Observe que o ar dentro da cânula micro deve ser deslocado.

Da mesma forma, a extremidade distal do tubo de polietileno pode exigir alguma dilatação com pinça microcirúrgica, e em seguida a extremidade proximal da cânula micro é inserida. Todo o sistema está agora livre de ar ou espaço morto e pode ser removido do banho salino e secado com gaze estéril. Em seguida, é aplicado Luma bond para fixar a cânula micro ao tubo de polietileno. Para reduzir a taxa de fluxo da bomba osmótica miniatura em aproximadamente metade, parafina estéril aquecida é despejada em uma pequena placa de Petri e a metade proximal da bomba osmótica miniatura é submersa brevemente.

O excesso de parafina é removido por absorção e o sistema de microinfusão é recolocado em salina estéril e armazenado até a cirurgia. Imediatamente antes da implantação cirúrgica, o fio guia é fixado na curvatura da micro cânula.

O eixo longitudinal do fio guia é alinhado com a porção da microcânula que entrará no tecido cerebral e é fixado com lumon. Nessa posição, o sistema de microinfusão pode então ser posicionado em um manipulador de instrumento estereotáxico.

O fio guia é fixado com uma braçadeira de manipulador, e a bomba é presa por cima com um laço de fio cirúrgico estéril. Isso suportará seu peso e permitirá que a microcânula seja perfeitamente alinhada perpendicularmente à superfície do crânio mediante a curvatura cuidadosa do fio guia com pinça; em seguida, o sistema de microinfusão pode ser implantado utilizando um procedimento estereotáxico padrão. O tubo de boel é fixado à superfície do crânio com adesivo.

Utilizamos o desmatador Jaron para moldar um pedestal de perfil baixo. O excesso de fio-guia que se estende acima da preparação é então cortado nivelado com a superfície do pedestal. Usando uma serra circular acoplada a uma broca de alta velocidade, a bomba osmótica miniatura pode então ser colocada subcutaneamente entre a nuca do animal.

O método atual oferece diversas vantagens em comparação com as técnicas tradicionais. Pode ser personalizado para acomodar a espécie e a idade do animal experimental. O tubo de sílica pode ser moldado para se ajustar à superfície do crânio do animal.

Portanto, permitindo uma fixação segura com perfil baixo e eliminando a necessidade de um pedestal craniano grande, a ferida cirúrgica pode ser facilmente fechada sobre o pedestal de microinfusão aerodinâmico, reduzindo assim o risco de infecção e o desconforto para o animal, além de exigir uma área superficial menor para fixar o sistema ao crânio. Dessa forma, procedimentos adicionais ou subsequentes podem ser realizados sem interferência de um pedestal maior. Mais importante ainda, este método reduz a invasividade e o trauma no ambiente local do sítio de infusão, minimizando, portanto, o efeito do observador.

Essas são as alterações que a observação ativa provocará no fenômeno observado.