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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA Solution</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>para dissociação de tecidos e preparação de suspensão de células únicas</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>para limpeza de RNA</td></tr><tr><td>AffinityScript Reverse Transcriptase</td><td>Agilent</td><td>600107</td><td>para síntese de cDNA eCLIP</td></tr><tr><td>Anti-CCT3 Antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab225878</td><td>anticorpo para eCLIP</td></tr><tr><td>Anti-PABPC1 Antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab312314</td><td>anticorpo para eCLIP&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>para extração de RNA</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>para dissociação enzimática de tecido testicular</td></tr><tr><td>Dephosphorylation reagents (T4 PNK)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td>para desfosforilação de RNA eCLIP</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>para cultura de células e buffer de dissociação de tecidos</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>para captura de complexos de sonda biotinilada-RNA-proteína</td></tr><tr><td>DynaMag-15 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12301D</td><td>para separação de contas magnéticas</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>para separação de contas magnéticas</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>para quelação de cátions divalentes em tampões de lise e lavagem</td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td>para purificação de cDNA eCLIP</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>para parar a digestão de tripsina</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td>para preparação de buffer de hibridização</td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>TUOHE</td><td>LF-I</td><td>para hibridização de sondas e lavagem de contas</td></tr><tr><td>Low-Melting-Temperature Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>para seleção de tamanho de biblioteca eCLIP</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>para seleção de tamanho de biblioteca eCLIP</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>para purificação de RNA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>para preparação de buffer de lavagem com alto teor de sal</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>GE Healthcare / Amersham</td><td>10600002</td><td>para transferência de western blot eCLIP</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85125</td><td>para detergente de buffer de lavagem</td></tr><tr><td>Nuclease- and protease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td>para preparar soluções livres de nucleases</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td>para seleção de tamanho eCLIP</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>para separação de proteínas SDS-PAGE</td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>para lavagem celular e ressuspensão</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>inibidor de protease serina para buffer de lise celular; adicionado fresco antes do uso</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>inibidor de protease de amplo espectro para buffer de lise celular; adicionado fresco antes do uso</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850</td><td>para digestão de proteínas na extração de RNA</td></tr><tr><td>qRT-PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11704044</td><td>para RT-PCR quantitativa para confirmar o enriquecimento de RNA</td></tr><tr><td>RNase/Protease-Free DNase I Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td>para dissociação de tecidos</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>para purificação de RNA</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Sample Loading Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0286</td><td>para preparação de amostra de proteína</td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>para purificação de cDNA eCLIP</td></tr><tr><td>Silver Stain Kit</td><td>Beyotime</td><td>P00175</td><td>para visualização de proteínas em géis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>para detergente de buffer de lavagem</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>para lise celular e desnaturação de proteínas</td></tr><tr><td>Superase-in RNase Inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td>inibidor de RNase especializado; adicionado fresco antes do uso</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>para ligação de adaptador eCLIP</td></tr><tr><td>Tris&ndash;HCl (pH 7.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>para preparar tampões de lise, hibridização e lavagem</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026CN</td><td>para extração de RNA</td></tr><tr><td>Ultrasonic cell crusher</td><td>ATPIO</td><td>ATPIO-650D</td><td>para lise celular e fragmentação de DNA</td></tr><tr><td>Ultraviolet Crosslinker</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP CL-1000</td><td>para reticulação UV de interações RNA-proteína</td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>para degradação de proteínas eCLIP na membrana</td></tr></tbody></table>

um método de chirp baseado em uv para a identificação verificável de proteínas que interagem diretamente com lncrna: de células cultivadas a testículos de camundongos

A UV-Based ChIRP Method For The Verifiable Identification of Proteins That Directly Interact With LncRNA: From Cultured Cells To Mouse Testis

Um método de ChIRP Baseado em UV para a Identificação Verificável de Proteínas que Interagem Diretamente com LncRNA: De Células Cultivadas a Testículos de Camundongos

Long non-coding RNAs (lncRNAs) have emerged as important regulators of diverse biological processes. However, the molecular mechanisms underlying the ...

Nossa pesquisa desenvolveu o cPDiRT, um método de reticulação com UV para mapear diretamente interações entre RNA e proteínas em células cultivadas e em tecidos nativos, como testículos, elucidando os mecanismos moleculares do TUG1 na espermatogênese. Este protocolo permite o mapeamento direto de interações entre RNA e proteína em uma ampla gama de sistemas, desde células cultivadas até tecidos nativos intactos. Para começar, lave as células GC2 três vezes com PBS para remover o meio de cultura residual.Em seguida, adicione três mililitros de PBS à placa e distribua uniformemente antes da reticulação. Irradie as células em um reticulador ultravioleta de 254 nanômetros com uma dose de 4.000 milijoules por centímetro quadrado. Colete as células em PBS e centrifugue a suspensão celular a 3000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Após descartar o sobrenadante, pese o pellet e confirme uma massa mínima do pellet de 500 miligramas por amostra. Colete os testículos de camundongos machos C57BL6 com quatro semanas de idade. Lave o tecido testicular descapsulado duas vezes com 5 a 10 mililitros de DMEM.Em seguida, incubar 100 miligramas de tecido com 10 mililitros de DMEM contendo um miligrama por mililitro de colagenase IV a 37 graus Celsius. Continuar a digestão por 5 a 15 minutos até que os túbulos seminíferos sejam liberados. Em seguida, centrifugar a suspensão a 1000G por um minuto a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante.Lave o pellet com 5 a 10 mililitros de DMEM. Centrifugue novamente a suspensão a 1000G durante um minuto a quatro graus Celsius. E ressuspenda o pellet em tripsina 0,25% contendo um miligrama por mililitro de desoxirribonuclease I. Incube a suspensão a 37 graus Celsius por 5 a 15 minutos.Em seguida, adicione um volume igual de DMEM suplementado com 10% de FBS para interromper a digestão enzimática. Filtre a suspensão através de um filtro celular de 70 micrômetros. Centrifugue as células a 2000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 5 a 10 mililitros de PBS. Centrifugue novamente a suspensão a 2000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda a suspensão de células isoladas em PBS e distribua-a uniformemente em uma placa de cultura de 15 centímetros.Realize a ligação cruzada das células testiculares conforme demonstrado anteriormente para as células GC2. Omita a irradiação para as células controle. Colete as células com ligação cruzada.Centrifugue a suspensão a 3000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Garanta uma massa mínima do pellet de 500 miligramas reunindo células testiculares isoladas de pelo menos 10 a 12 camundongos. Após pesar o pellet, re-suspenda-o em tampão de lise celular na proporção de 100 miligramas de pellet por um mililitro de tampão.Após a vórtex, sonique a amostra usando um ultrassonicator focalizado ou um banho de ultrassom até que o lisado fique visualmente claro. Em seguida, alíquotas de aproximadamente 10 microlitros do lisado em tubos de microcentrífuga para análise de RNA e proteína. Adicione 30 microlitros de esferas magnéticas pré-lavadas ao lisado.Incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos com mistura suave em uma estufa de hibridização. Coloque as amostras em um suporte magnético por aproximadamente um minuto ou até que a solução fique límpida. Transfira o lisado clarificado para um tubo novo.Coloque o novo tubo no suporte magnético. Em seguida, transfira o lisado para outro tubo para remover quaisquer microesferas residuais. Adicione dois volumes do tampão de hibridização temperado a 37 graus Celsius a cada amostra.Adicione as sondas de DNA biotiniladas na proporção de um microlitro de estoque de sonda a 100 micromolar por um mililitro de lisado. Incube as amostras a 37 graus Celsius com rotação end-over-end por 12 a 16 horas em uma estufa de hibridização. Imediatamente antes do uso, lave 100 microlitros de microesferas magnéticas de estreptavidina três vezes com tampão de lise celular.E remova o tampão residual após a lavagem final. Centrifugue brevemente os tubos da reação de hibridização. Em seguida, adicione a amostra hibridizada às esferas lavadas e misture suavemente.Retorne a suspensão de microesferas ao tubo original e incube a 37 graus Celsius com agitação por 30 a 40 minutos. Após a incubação, centrifugue brevemente as amostras. Coloque os tubos em um suporte magnético por um a dois minutos, ou até que a solução fique límpida.Em seguida, descarte o sobrenadante. Para lavar as microesferas, adicione um mililitro do tampão de lavagem e incube os tubos no forno de hibridização a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após cinco lavagens, transfira 1-10% das microesferas para um tubo novo para análise de RNA.Finalmente, adicione 40 microlitros de tampão amostral 1X SDS às microesferas restantes. Incube as amostras a 95 graus Celsius por 30 minutos para eluir as proteínas e reverter os cruzamentos. Recupere as proteínas para análise subsequente por espectrometria de massa.A análise por espectrometria de massas ChIRP identificou mais de 190 proteínas enriquecidas em relação ao controle negativo em células GC2. Com uma dose de UV de 4.000 milijoules por centímetro quadrado, o cPDiRT-MS identificou um conjunto de proteínas mais seletivo. Mais de dois terços dessas proteínas coincidiram com as identificadas pelo ChIRP-MS convencional.A maioria das proteínas identificadas com pelo menos dois peptídeos únicos foi detectada de forma reprodutível entre réplicas biológicas, tanto em células GC2 quanto em testículos de camundongo. A análise de ontologia genética das proteínas identificadas de forma reprodutível revelou processos biológicos amplamente compatíveis com as funções conhecidas de TUG1. A comparação dos conjuntos de dados de células GC2 e testículos de camundongo identificou 15 proteínas que foram comumente enriquecidas.A sequência de imunoprecipitação com enriquecimento por reticulação revelou picos de ligação claros e específicos no transcrito TUG1 para PABPC1 e CCT3. O cPDiRT permite aos pesquisadores identificar e quantificar proteínas que interagem diretamente com RNA ligado específico, tanto em células cultivadas quanto em tecidos nativos. O desafio mais importante é obter uma reticulação eficiente por UV, garantindo ao mesmo tempo alta especificidade para interações diretas entre RNA e proteína.Nosso protocolo apoiará estudos futuros para aplicar esta abordagem a outros RNAs e tecidos, reafirmando a ação direta do RNA proteico no desenvolvimento e na reprodução.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um passo a passo para protocolo de isolamento e identificação de RNA complexos associados através de RIP-Chip.

Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

CHIRP é uma técnica recente e rápida de mapa genômico sítios de ligação de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs). O método tira partido da especificidade dos oligonucleótidos anti-sentido ladrilhos para permitir que a enumeração de sítios lncRNA-bound genómicos.

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Nós apresentamos uma variação da abordagem QUICK (Imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown) que foi introduzida anteriormente para distinguir entre verdadeiros e falsos interacções proteína-proteína. A nossa abordagem é...

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Este vídeo demonstra o método de imunoprecipitação de reticulação aprimorada (eCLIP) para identificar proteínas de ligação a RNA em testículos de camundongos. O eCLIP permite a identificação precisa de locais de ligação onde as proteínas de ligação a RNA (RBPs) interagem com seus RNAs alvo.

Um método aprimorado de imunoprecipitação de reticulação para identificação eficiente de RNA ligado a proteínas em testículos de camundongos

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

A identificação luminescente de elementos funcionais em regiões 3' não traduzidas (3'UTRs) (3'LIFE) é uma técnica para identificar a regulação funcional em 3'UTRs por miRNAs ou outros fatores regulatórios. Este protocolo utiliza metodologia de alto rendimento, como transfecção de 96 poços e ensaios de luciferase, para rastrear centenas de interações putativas quanto à repressão funcional.

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Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Aqui, nós apresentamos um protocolo de eCLIP para determinar alvos principais do RNA de candidatos do RBP no testis.

Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato

Nanjing Medical University.  Um método ChIRP baseado em UV para identificar interações diretas entre lncRNA e proteína.

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