Um método de ChIRP Baseado em UV para a Identificação Verificável de Proteínas que Interagem Diretamente com LncRNA: De Células Cultivadas a Testículos de Camundongos
10 de julho de 2026
Um método ChIRP baseado em UV para identificar interações diretas entre lncRNA e proteína.
Nossa pesquisa desenvolveu o cPDiRT, um método de reticulação com UV para mapear diretamente interações entre RNA e proteínas em células cultivadas e em tecidos nativos, como testículos, elucidando os mecanismos moleculares do TUG1 na espermatogênese. Este protocolo permite o mapeamento direto de interações entre RNA e proteína em uma ampla gama de sistemas, desde células cultivadas até tecidos nativos intactos. Para começar, lave as células GC2 três vezes com PBS para remover o meio de cultura residual.
Em seguida, adicione três mililitros de PBS à placa e distribua uniformemente antes da reticulação. Irradie as células em um reticulador ultravioleta de 254 nanômetros com uma dose de 4.000 milijoules por centímetro quadrado. Colete as células em PBS e centrifugue a suspensão celular a 3000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Após descartar o sobrenadante, pese o pellet e confirme uma massa mínima do pellet de 500 miligramas por amostra. Colete os testículos de camundongos machos C57BL6 com quatro semanas de idade. Lave o tecido testicular descapsulado duas vezes com 5 a 10 mililitros de DMEM.
Em seguida, incubar 100 miligramas de tecido com 10 mililitros de DMEM contendo um miligrama por mililitro de colagenase IV a 37 graus Celsius. Continuar a digestão por 5 a 15 minutos até que os túbulos seminíferos sejam liberados. Em seguida, centrifugar a suspensão a 1000G por um minuto a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante.
Lave o pellet com 5 a 10 mililitros de DMEM. Centrifugue novamente a suspensão a 1000G durante um minuto a quatro graus Celsius. E ressuspenda o pellet em tripsina 0,25% contendo um miligrama por mililitro de desoxirribonuclease I. Incube a suspensão a 37 graus Celsius por 5 a 15 minutos.
Em seguida, adicione um volume igual de DMEM suplementado com 10% de FBS para interromper a digestão enzimática. Filtre a suspensão através de um filtro celular de 70 micrômetros. Centrifugue as células a 2000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 5 a 10 mililitros de PBS. Centrifugue novamente a suspensão a 2000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda a suspensão de células isoladas em PBS e distribua-a uniformemente em uma placa de cultura de 15 centímetros.
Realize a ligação cruzada das células testiculares conforme demonstrado anteriormente para as células GC2. Omita a irradiação para as células controle. Colete as células com ligação cruzada.
Centrifugue a suspensão a 3000G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Garanta uma massa mínima do pellet de 500 miligramas reunindo células testiculares isoladas de pelo menos 10 a 12 camundongos. Após pesar o pellet, re-suspenda-o em tampão de lise celular na proporção de 100 miligramas de pellet por um mililitro de tampão.
Após a vórtex, sonique a amostra usando um ultrassonicator focalizado ou um banho de ultrassom até que o lisado fique visualmente claro. Em seguida, alíquotas de aproximadamente 10 microlitros do lisado em tubos de microcentrífuga para análise de RNA e proteína. Adicione 30 microlitros de esferas magnéticas pré-lavadas ao lisado.
Incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos com mistura suave em uma estufa de hibridização. Coloque as amostras em um suporte magnético por aproximadamente um minuto ou até que a solução fique límpida. Transfira o lisado clarificado para um tubo novo.
Coloque o novo tubo no suporte magnético. Em seguida, transfira o lisado para outro tubo para remover quaisquer microesferas residuais. Adicione dois volumes do tampão de hibridização temperado a 37 graus Celsius a cada amostra.
Adicione as sondas de DNA biotiniladas na proporção de um microlitro de estoque de sonda a 100 micromolar por um mililitro de lisado. Incube as amostras a 37 graus Celsius com rotação end-over-end por 12 a 16 horas em uma estufa de hibridização. Imediatamente antes do uso, lave 100 microlitros de microesferas magnéticas de estreptavidina três vezes com tampão de lise celular.
E remova o tampão residual após a lavagem final. Centrifugue brevemente os tubos da reação de hibridização. Em seguida, adicione a amostra hibridizada às esferas lavadas e misture suavemente.
Retorne a suspensão de microesferas ao tubo original e incube a 37 graus Celsius com agitação por 30 a 40 minutos. Após a incubação, centrifugue brevemente as amostras. Coloque os tubos em um suporte magnético por um a dois minutos, ou até que a solução fique límpida.
Em seguida, descarte o sobrenadante. Para lavar as microesferas, adicione um mililitro do tampão de lavagem e incube os tubos no forno de hibridização a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após cinco lavagens, transfira 1-10% das microesferas para um tubo novo para análise de RNA.
Finalmente, adicione 40 microlitros de tampão amostral 1X SDS às microesferas restantes. Incube as amostras a 95 graus Celsius por 30 minutos para eluir as proteínas e reverter os cruzamentos. Recupere as proteínas para análise subsequente por espectrometria de massa.
A análise por espectrometria de massas ChIRP identificou mais de 190 proteínas enriquecidas em relação ao controle negativo em células GC2. Com uma dose de UV de 4.000 milijoules por centímetro quadrado, o cPDiRT-MS identificou um conjunto de proteínas mais seletivo. Mais de dois terços dessas proteínas coincidiram com as identificadas pelo ChIRP-MS convencional.
A maioria das proteínas identificadas com pelo menos dois peptídeos únicos foi detectada de forma reprodutível entre réplicas biológicas, tanto em células GC2 quanto em testículos de camundongo. A análise de ontologia genética das proteínas identificadas de forma reprodutível revelou processos biológicos amplamente compatíveis com as funções conhecidas de TUG1. A comparação dos conjuntos de dados de células GC2 e testículos de camundongo identificou 15 proteínas que foram comumente enriquecidas.
A sequência de imunoprecipitação com enriquecimento por reticulação revelou picos de ligação claros e específicos no transcrito TUG1 para PABPC1 e CCT3. O cPDiRT permite aos pesquisadores identificar e quantificar proteínas que interagem diretamente com RNA ligado específico, tanto em células cultivadas quanto em tecidos nativos. O desafio mais importante é obter uma reticulação eficiente por UV, garantindo ao mesmo tempo alta especificidade para interações diretas entre RNA e proteína.
Nosso protocolo apoiará estudos futuros para aplicar esta abordagem a outros RNAs e tecidos, reafirmando a ação direta do RNA proteico no desenvolvimento e na reprodução.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um fluxo de trabalho baseado em UV para ChIRP (identificação abrangente de proteínas que interagem com RNA), denominado cPDiRT, destinado à identificação de proteínas que interagem diretamente com RNAs não codificantes longos (lncRNAs) em células cultivadas e em tecidos nativos. Utilizando o lncRNA Tug1 como modelo, o estudo compara estratégias de reticulação com UV e paraformaldeído (PFA), demonstrando que a reticulação com UV enriquece as interações diretas RNA-proteína e permite a descoberta de interatores compartilhados e específicos de tecido.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia molecular
- Biologia do RNA
- Proteômica
Contexto
- Os lncRNAs são importantes reguladores de diversos processos biológicos.
- Os mecanismos moleculares da maioria dos lncRNAs permanecem pouco claros.
- A identificação de proteínas que se ligam ao RNA (RBPs) é fundamental para compreender a função dos lncRNAs.
- A espectrometria de massa ChIRP é um método amplamente utilizado para mapear interações entre lncRNAs e proteínas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e validar um protocolo ChIRP baseado em UV (cPDiRT) para identificar interações diretas entre lncRNA e proteínas.
- Comparar a reticulação por UV e por PFA no âmbito do protocolo ChIRP.
- Ampliar o protocolo para contextos teciduais nativos, como testículos de camundongo.
Métodos Utilizados
- ChIRP acoplado à espectrometria de massas para identificação de proteínas.
- Comparação entre reticulação por UV e reticulação por PFA em células cultivadas.
- Dissociação de tecido e reticulação por UV em testículos de camundongo para obtenção de suspensões de células únicas.
- Validação de interações diretas utilizando imunoprecipitação com reticulação aprimorada (eCLIP).
Resultados Principais
- O ChIRP baseado em UV enriquece preferencialmente interações diretas entre lncRNA e proteínas, em comparação com métodos baseados em PFA.
- O fluxo de trabalho cPDiRT identifica com sucesso proteínas que interagem com Tug1 em células cultivadas e em tecidos nativos.
- A comparação dos interatoma revela interações entre lncRNA e proteínas comuns e específicas de tecido.
- Duas interações diretas comuns foram validadas independentemente por eCLIP.
Conclusões
- cPDiRT é um método eficaz para identificar proteínas que se ligam diretamente a lncRNAs em diversos contextos biológicos.
- A combinação de dissociação tecidual e reticulação com UV amplia a aplicabilidade do ChIRP a tecidos nativos.
- Essa abordagem facilita o estudo das interações entre lncRNAs e proteínas em diversos sistemas orgânicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação direta de interações entre lncRNA e proteínas é fundamental para a validação de alvos e a redução de incertezas mecanicistas em fases iniciais de descoberta. O protocolo baseado em UV ChIRP (cPDiRT) permite o mapeamento com alta confiança de contatos diretos entre RNA e proteínas, tanto em células cultivadas quanto em tecidos nativos, apoiando a confiabilidade preditiva em genômica funcional e pesquisas translacionais. Esta abordagem aprimora a tomada de decisões em portfólios ao distinguir interatores diretos de associações indiretas, reduzindo a ambiguidade na biologia do alvo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação rigorosa da função de lncRNA por meio da identificação direta de parceiros proteicos.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao distinguir interações diretas de interações indiretas entre RNA e proteína.
- Melhora a confiança preditiva nos fluxos de trabalho de seleção e validação de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para triagem subsequente de moduladores de RNA-proteína.
- Fornece dados quantitativos do interatoma para padronização e reprodutibilidade de ensaios.
- Permite avaliação robusta dos efeitos de compostos sobre interações diretas de lncRNA-proteína.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Amplia o mapeamento direto do interatoma para tecidos nativos, apoiando estudos de sistemas relevantes para doenças.
- Alinha descobertas de pesquisa ao desenvolvimento translacional de biomarcadores mediante a validação de interações específicas de tecidos.
- Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao confirmar a relevância biológica em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O fluxo de trabalho cPDiRT integra desde a descoberta inicial até a pesquisa pré-clínica, permitindo a validação direta de alvos e insights mecanicistas em diferentes sistemas modelo e tecidos.
- Biologia da Descoberta: Fornece mapeamento de alta especificidade de interações lncRNA-proteína para testes de hipóteses e esclarecimento de vias.
- Triagem: Fornece dados quantitativos e reprodutíveis do interatoma para orientar a preparação de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Gera resultados baseados em espectrometria de massas para análise comparativa de interatomas em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descoberta e validação pré-clínica ao permitir estudos diretos de interação em tecidos nativos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma amplamente aplicável para mapeamento direto de interações RNA-proteína em diversos sistemas orgânicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza o mapeamento de interatoma com fluxos de trabalho escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Apoia decisões informadas de avançar/não avançar e a gestão eficiente de portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao confirmar a relevância biológica direta dos alvos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em biologia de RNA, proteômica e análise de espectrometria de massas.
- Exige acesso a equipamentos de reticulação por UV e plataformas analíticas de alta sensibilidade.
- Necessita padronização entre equipes para o design de sondas e protocolos de processamento de tecidos.
- Adaptável a sistemas de células cultivadas e tecidos dissociados, garantindo ampla aplicabilidade.
- Passos rigorosos de lavagem e validação são essenciais para assegurar especificidade em interações diretas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:37
Ultraviolet Crosslinking of Cultured GC2 Cells
1:26
Isolation of Mouse Testicular Cells
2:59
UV Crosslinking of Testicular Cells
4:06
Cell Lysis and Lysate Preclearing
5:18
Probe Hybridization and Bead-Based Capture
7:23
Results
8:45
Conclusion
