Princípios do site-specific Recombinase (SSR) Tecnologia

Olá, meu nome é Frank Buchholz. Sou líder de grupo aqui no Instituto Max PL de Biologia Celular e Genética Molecular. E o nosso trabalho é mantido.

Temos dois aspectos em nosso trabalho. Um está relacionado à triagem de RNA I. O outro está relacionado ao desenvolvimento de recombinase específica de sítio para engenharia avançada do genoma.

Minha formação é de bióloga, uma bióloga molecular, e estudei genética na biologia. Em seguida, realizei meu doutorado nos Laboratórios Europeus de Biologia Molecular em Heidelberg e depois meu pós-doutorado em São Francisco na UCSF com Mike Bishop, trabalhando em modelos animais de leucemia. O Instituto Max Puncture aqui em Dresden tenta combinar, digamos, pelo menos dois aspectos diferentes, que são biólogos do desenvolvimento e biólogos celulares, com o objetivo principal, creio eu, do que se poderia dizer ser o tema básico deles: tentar compreender como as células formam tecidos.

Esse é basicamente o objetivo geral do instituto aqui em Ston. Então trabalhamos em dois campos, basicamente. Um dos campos diz respeito à realização de telas de RNAi, tentando identificar funções novas de genes previamente não caracterizados em processos biológicos.

O outro trata da engenharia genômica, com o objetivo de desenvolver tecnologias que permitam a engenharia sofisticada de genomas utilizando recombinases específicos de sítio. Embora os recombinases específicos de sítio tenham sido descobertos, digamos, na década de oitenta — por exemplo, a recombinase cre com a qual trabalhamos foi descoberta no início da década de oitenta —, na verdade trata-se de uma proteína de fago bacteriano. Assim, ela originalmente provém de um fago bacteriano, ou seja, basicamente de um vírus que infecta bactérias.

Portanto, está muito distante do que é atualmente utilizado, mas foi reconhecido rapidamente que essas enzimas podem desempenhar funções muito interessantes que podem ser aproveitadas em outros organismos também. Assim, as recombinases específicas de sítio são proteínas que se ligam ao DNA, ligando-se especificamente a uma determinada sequência de DNA, e quando se ligam a essas sequências-alvo, são capazes de cortar o DNA e também rearranjar os sítios, realizando basicamente o processo de ligação. Mais uma vez, é possível rearranjar sequências de DNA por meio dessa recombinação específica de sítio, de forma semelhante a tesouras e cola, com as quais basicamente se podem unir sequências de DNA de um modo que anteriormente não era possível.

Essas recombinases específicas de sítio, como eu disse, foram originalmente descobertas em bactérias ou em fagos bacterianos. Em seguida, testou-se se elas também funcionavam em outros organismos. E, curiosamente, elas desempenharam sua função também em outros organismos.

Portanto, se você tiver um sítio-alvo de recombinase específica de local em um organismo que tenha sido modificado, por exemplo, essas enzimas desempenharão sua função. O uso muito destacado dessas recombinases específicas de local, em particular aquelas que não necessitam de cofatores, como a recombinase flip ou a recombinase cre, que utilizamos como ponto de partida para o trabalho que estamos discutindo aqui hoje, é que elas atuam sem cofatores.

E se você as expressar em, em um, em um animal, por exemplo, ou em células de um animal, então elas podem localizar as sequências que reconhecem nesse organismo e, basicamente, cortar e colar exatamente ali, removendo certas sequências. Assim, o que tem sido feito, ou seja, onde essa enzima tem sido usada com grande sucesso, é na chamada mutagênese condicional em camundongos, por exemplo. Digamos que você tenha um gene, que sabe ser um gene interessante, e deseje saber qual é a função desse gene.

Um experimento muito proeminente é a criação do chamado camundongo knockout. Para aqueles que você viu recentemente, essa tecnologia também recebeu o Prêmio Nobel este ano, permitindo, basicamente, a deleção de um gene em um camundongo. No entanto, às vezes se descobre que, ao eliminar um gene em um animal, esse gene é essencial e o camundongo morre muito cedo durante a embriogênese.

Agora isso indica que seu gene é muito importante, mas não revela realmente qual é a função. Assim, um método muito utilizado atualmente para descobrir isso é realizar uma eliminação condicional. O que se faz é flanquear o gene de interesse com sítios-alvo para essas recombinases específicas de sítio.

E isso significa que nesses camundongos, o gene será expresso como em camundongos selvagens. Mas agora, se você cruzar esses camundongos com um camundongo que expressa a recombinase CRE, por exemplo, sob um promotor específico de tecido, então é possível deletar o gene de interesse apenas em células específicas que podem ser previamente definidas com base no local onde a recombinase é expressa. E desses experimentos, também sabemos que essas recombinações podem ser muito eficientes na deleção de sequências em organismos inteiros.

E isso era um pré-requisito para a nossa ideia de tentar desenvolver uma recombinase que corte no sítio que pré-definimos, o qual até então era uma das principais limitações para o desenvolvimento adicional do sítio. Com as recombinases específicas, era necessário projetar o sítio-alvo de reconhecimento no genoma de uma célula de um organismo que se desejava utilizar. Então, pensamos: será que podemos quebrar essa barreira?

Basicamente utilizando a evolução molecular. No momento, as recombinases específicas de sítio não são usadas em terapias, até onde sei. Como eu disse, isso se deve principalmente ao fato de que não se terá um sítio alvo no ser humano que seja reconhecido por qualquer uma das recombinases disponíveis na natureza.

Portanto, eles precisam ser modificados primeiro para poderem ser utilizados em um contexto terapêutico. Agora estamos apenas no início, e ainda é incerto se isso será possível. O tempo dirá se realmente seremos capazes de desenvolver essas enzimas para uso terapêutico, e o tempo também dirá se isso é ou não viável.