Name: Geração de neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ASCL1/DLX2 em AAVS1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a gerar neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ASCL1/DLX2 em AAVS1. Este método oferece diferenciação eficiente e reprodutível para modelagem de doenças neurológicas.

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	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
	<li>Barabino A, Flamier A, Hanna R, H&#233;on E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.</li>
	<li>Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer&#8217;s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.</li>
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	<li>Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).</li>
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<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td>Para eletroporação/nucleofecção de hiPSCs.</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>Placas tratadas para cultura de tecidos para manutenção e diferenciação de hiPSCs.</td></tr><tr><td>BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>Proteína humana recombinante para maturação neuronal; prepare de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>Cell counter (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td>Usado para contagem de células.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>Para peletagem celular.</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i ou equivalente</td><td>Incubadora de cultura celular mantendo 37 &deg;C, atmosfera umidificada e 5% CO2.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>Frascos criogênicos estéreis para congelamento de hiPSCs; criovial de 1,8 a 2,0 mL com rosca externa equivalente pode ser usado.</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>Matriz de revestimento BME padrão usada no protocolo. Verifique a concentração de estoque específica do lote do certificado de análise da Bio-Techne e dilua em DMEM/F-12 para uma concentração de trabalho de 80 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>Meio basal usado para diluir BME.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Crioprotetor usado na preparação do meio de congelamento.</td></tr><tr><td>Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette</td><td>Custom plasmid</td><td>Addgene accession pending</td><td>Plasmídeo doador AAVS1 personalizado contendo a cassette indutível por doxiciclina ASCL1-P2A-DLX2 e elementos de seleção/relatado. Forneça o mapa do plasmídeo e a sequência completa como arquivo complementar ou mediante solicitação.</td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Usado para induzir a expressão de ASCL1-P2A-DLX2. Prepare solução de estoque estéril, aliquote, proteja da luz, armazene congelado e use em concentração final de 1 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td>Commercial Alcohols / Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Para esterilização dentro do gabinete de segurança biológica; use etanol 70% aprovado institucionalmente ou equivalente.</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Microscópio usado para imagem de contraste de fase e fluorescência da expressão de relatador e morfologia neuronal.</td></tr><tr><td>GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>Proteína humana recombinante para maturação neuronal; prepare de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>hiPSC line PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 human iPSC line</td><td>Linha de hiPSC humana de consentimento aberto disponível comercialmente usada neste protocolo; registre o número de passagem e o status de QC antes da edição e diferenciação.</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>Open-source; version used should be reported</td><td>Para quantificação de fluorescência e processamento de imagem representativa.</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; Serum Replacement (KOSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Usado na preparação do meio de congelamento.</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>Reagente opcional de solução de problemas. Não faz parte do protocolo de revestimento padrão; pode ser usado como uma alternativa ou matriz de revestimento duplo se a desconexão neuronal persistir.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Locator 6 Plus ou equivalente</td><td>Armazenamento de longo prazo de hiPSCs congelados em fase de vapor ou nitrogênio líquido de acordo com os procedimentos de segurança criogênica institucionais.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Para congelamento controlado de células a -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Meio de manutenção livre de alimentadores para hiPSCs.</td></tr><tr><td>Neuro-induction medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>Meio comercial de indução neuronal usado para indução neuronal precoce.</td></tr><tr><td>Neuro-maturation base medium (BrainPhys&trade; Neuronal Medium)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>Meio base para maturação neuronal; suplementar com BDNF, GDNF, NT-3, doxiciclina e PluriSln-1 conforme descrito no protocolo.</td></tr><tr><td>NT-3 (Neurotrophic Factor 3)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>Proteína humana recombinante para maturação neuronal; prepare de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Kit contendo Solução P3 e cuvetes para nucleofecção de hiPSCs.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Antibiótico opcional para reduzir o risco de contaminação bacteriana.</td></tr><tr><td>Plasmocin&trade; prophylactic</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpp</td><td>Antibiótico opcional para prevenir contaminação por micoplasma.</td></tr><tr><td>PluriSIn-1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72822</td><td>Inibidor de sobrevivência de células pluripotentes para eliminar hiPSCs indiferenciadas; prepare o estoque de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 20 &micro;M.</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113803</td><td>Antibiótico usado para seleção; prepare solução estéril de estoque, aliquote, armazene congelado e determine a concentração final de trabalho por curva de morte, tipicamente 0,4-0,6 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmid</td><td>Addgene</td><td>85802</td><td>Plasmídeo CRISPR/Cas9 usado para direcionamento de AAVS1; inclua a sequência gRNA AAVS1 no mapa do plasmídeo ou informações complementares.</td></tr><tr><td>qPCR analysis software</td><td>Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific</td><td>QuantStudio Design &amp; Analysis Software ou equivalente</td><td>Para extração de Ct e análise de RT-qPCR; relatar a versão do software usada.</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PowerUp SYBR Green Master Mix, A25742</td><td>Para quantificação por RT-qPCR de marcadores neuronais e GABAérgicos.</td></tr><tr><td>qPCR primers: DLX1</td><td>Custom oligonucleotides</td><td>Sequence provided in comments</td><td>Direto: 5' ATGCACTGTTTACACTCGGC 3'; Reverso: 5' GACTGCAC

geração de neurônios gabaérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ascl1/dlx2 em aavs1

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

Geração de neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ASCL1/DLX2 em AAVS1

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

Nossa pesquisa concentra-se na geração de uma população pura de neurônios GABAérgicos a partir de hiPSCs para modelar a diversidade neuronal humana e doenças. Os protocolos existentes exigem transdução viral repetida para cada diferenciação. Este protocolo aborda essa limitação utilizando uma linhagem celular AAVS1.Para começar, prepare o meio de congelamento combinando 40 mililitros de substituto sérico para knock-out ou KOSR e 10 mililitros de DMSO em um tubo cônico de 50 mililitros. Homogeneíze o meio de congelamento pipetando para cima e para baixo 10 vezes e armazene a solução a 4 graus Celsius. Em seguida, dilua o extrato de membrana basal ou BME em meio DMEM e F12 até uma concentração final de 80 microgramas por mililitro. Adicione 1 mililitro do BME diluído a cada poço de uma placa de seis poços. Incline a placa para distribuir a solução uniformemente por toda a superfície dos poços, garantindo que não haja áreas não revestidas, e incube a placa por um mínimo de 30 minutos a 37 graus Celsius.Usando uma pipeta aspiradora, aspire o meio dos poços contendo as células-tronco pluripotentes induzidas humanas, ou hiPSCs. Adicione 1 mililitro de ReLeSR ao poço e incube por 30 segun

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação de corpos embrióides (EBs) em agregados neuroepiteliais e sua subsequente divisão em células neuronais e gliais. Este método permite a geração eficiente de células neuronais e gliais in vitro, que servem como sistemas de teste para testes de toxicidade, bem como avaliação de diferentes vias envolvidas na neurotoxicidade.

Geração de neurônios e células gliais a partir de corpos embrióides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Este vídeo demonstra o processo de indução de células-tronco pluripotentes humanas a se diferenciarem em neurônios, transfectando-as com lentivírus modificados carregando um gene do fator de transcrição neurogênico sob o controle do elemento responsivo à tetraciclina, seguido de tratamento com um derivado de tetraciclina e meio de maturação.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando lentivírus projetados

Este procedimento gera os neurónios telencefálicos atravessando checkpoints que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. As células são deixadas a diferenciar-se espontaneamente, são expostas a factores que os empurram no sentido da linhagem neural, são isolados, e são plaqueadas em lamelas de cobertura para permitir a diferenciação terminal e maturação.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

A modelagem do desenvolvimento do cérebro humano foi prejudicada devido à complexidade sem precedentes do tecido epitelial neural. Aqui, é descrito um método para a geração robusta de organoides cerebrais para delinear eventos iniciais do desenvolvimento do cérebro humano e modelar a microcefalia in vitro.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

As interações neurônio-glial na neurodegeneração não são bem compreendidas devido a ferramentas e métodos inadequados. Aqui, descrevemos protocolos otimizados para obter neurônios induzidos, células precursoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos de células-tronco pluripotentes humanas e fornecemos exemplos dos valores desses métodos na compreensão das contribuições específicas do tipo celular na doença de Alzheimer.

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

O transplante de neurônios GABAérgicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas gerados pela programação neuronal pode ser uma abordagem de tratamento potencial para distúrbios do neurodesenvolvimento. Este protocolo descreve a geração e o transplante de precursores neuronais GABAérgicos derivados de células-tronco humanas no cérebro de camundongos neonatais, permitindo a investigação a longo prazo de neurônios enxertados e a avaliação de seu potencial terapêutico.

Transplante de neurônios gabaérgicos derivados de células-tronco humanas no hipocampo de camundongo pós-natal precoce para mitigar distúrbios do neurodesenvolvimento

Aprenda a gerar neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ASCL1/DLX2 em AAVS1. Este método oferece diferenciação eficiente e reprodutível para modelagem de doenças neurológicas.

Geração de neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ASCL1/DLX2 em AAVS1 (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ASCL1/DLX2 em AAVS1

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