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Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82273554), pelo Projeto de Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Saúde da Província de Shandong (nº 202304030716), pelo Programa Nacional de Treinamento em Inovação e Empreendedorismo para Estudantes Universitários da China (nº 202410439001) e pelo Projeto de Desenvolvimento de Inovação Científica e Tecnológica de Tai’an (nº 2023NS232).

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em experimentação animal da Universidade Médica de Shandong &amp;#38; Academia de Ciências Médicas de Shandong (W202112030345). Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes.
1. Fabricação dos patches 3BDO@MN
<ol>
	<li>Preparação da formulação de CS/HA
	<ol>
		<li>Pese 1 g do pó de CS (grau de desacetilação ≥ 95%) e adicione-o a 20 mL de água destilada, seguido de agitação à temperatura ambiente (TA) por 10 min.</li>
		<li>Continue adicionando 0,4 mL de solução de ácido acético 2% (v/v) (massa molecular 60,05) e continue agitando por 2 h. 
		CAUTION: O ácido acético concentrado é corrosivo. Realize a diluição e o manuseio em capela, e use luvas descartáveis e óculos de proteção para evitar contato com a pele e membranas mucosas.</li>
		<li>Continue com a adição de 2 g do pó de HA e, em seguida, centrifugue a formulação mista a 1.207 × g (aproximadamente 3.000 rpm) por 5 min para garantir dissolução completa. 
		&#8203;NOTA: A formulação de CS/HA deve ser preparada fresca e pode ser mantida em geladeira a 4 °C por não mais de 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação da formulação de CS/HA carregada com 3BDO
	<ol>
		<li>Adicione a solução pré-dissolvida de 3BDO (2 mg/mL) em dimetilsulfóxido (DMSO) 
		CAUTION: O DMSO é permeável à pele. Use luvas durante a operação para evitar contato direto com a pele e adicione-o à formulação de CS/HA. Misture bem para garantir dissolução completa.</li>
		<li>Centrifugue a formulação mista a 1.207 × g por 5 min para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas. 
		&#8203;NOTA: Se as bolhas persistirem após a centrifugação, deixe a formulação repousar por 5 min e, em seguida, centrifugue novamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fabricação dos patches de MN com 3BDO@MN
	<ol>
		<li>Utilize um molde de MN de polidimetilsiloxano (PDMS), com uma matriz 20 × 20 de pontas cônicas com altura de 600 µm, diâmetro da base de 250 µm e passo de 550 µm.</li>
		<li>Trate a superfície do molde de PDMS utilizando um limpador de plasma para torná-lo completamente hidrofílico.</li>
		<li>Adicione 1 mL da formulação de 3BDO@CS/HA ao molde de MN de PDMS. Coloque o molde em uma câmara de vácuo e aplique vácuo por 10 min para facilitar a infiltração da formulação viscosa nas microcavidades.</li>
		<li>Centrifugue o molde a 134 × g por 5 min à TA para garantir que a formulação preencha todas as cavidades. Utilize um raspador metálico estéril para remover cuidadosamente o excesso de formulação da superfície do molde, deixando um plano perfeitamente plano.</li>
		<li>Dispense a mistura da matriz de CS/HA sem 3BDO sobre a superfície do molde. Centrifugue a 134 × g por 5 min à TA para formar uma camada de reforço uniforme.</li>
		<li>Coloque o molde em uma estufa a 36 °C e 37% de umidade e seque-o durante a noite (aproximadamente 12–16 h).</li>
		<li>Retire com cuidado o patch de MN completamente seco do molde após o molde atingir a TA. 
		NOTA: Mantenha os patches de 3BDO@MN fabricados armazenados em geladeira a 4 °C até o momento de uso.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Caracterização dos patches de 3BDO@MN
<ol>
	<li>Monte o curativo 3BDO@MN preparado sobre um suporte usando fita de carbono condutiva dupla face.
	<ol>
		<li>Recubra por pulverização catódica a amostra montada com uma fina camada de ouro (ou platina) para aumentar a condutividade elétrica.</li>
		<li>Insira o suporte com a amostra na câmara a vácuo de um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo (MEV-EF).</li>
		<li>Ajuste a tensão de aceleração e a distância de trabalho para obter imagens de alta resolução. Observe a morfologia geral do arranjo e a topografia superficial detalhada das MNs individuais.</li>
		<li>Adquira micrografias representativas de MEV. Meça o comprimento das MNs e o diâmetro da ponta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Teste de resistência mecânica
	<ol>
		<li>Coloque o curativo de MNs plano sobre a plataforma do analisador de textura. Certifique-se de que o substrato esteja perfeitamente plano e que as pontas das agulhas estejam voltadas diretamente para cima.</li>
		<li>Fixe firmemente uma sonda cilíndrica plana (25 mm de diâmetro) ao célula de carga do instrumento.</li>
		<li>Desça a sonda verticalmente até que ela fique posicionada logo acima das pontas das MNs. Evite qualquer contato físico entre a sonda e as pontas antes do teste.</li>
		<li>Defina os parâmetros específicos de teste no software: ajuste a velocidade de descida para 0,05 mm/s e defina a distância-alvo de deslocamento para 0,7 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Teste de dissolução
	<ol>
		<li>Estique a pele dorsal de rato sobre uma placa de dissecação e seque a superfície da pele com papel absorvente. Mantenha a pele plana e sem rugas.</li>
		<li>Coloque os curativos de MNs secos com as pontas das agulhas voltadas para baixo sobre a superfície da pele e aplique pressão vertical uniforme para garantir a inserção das MNs na pele.</li>
		<li>Remova os curativos da pele em intervalos de tempo predeterminados (5, 10, 30 e 60 s) e seque por 5 min.</li>
		<li>Observe a morfologia residual por MEV nas mesmas condições de imagem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ensaios in vitro de liberação de fármaco
	<ol>
		<li>Adicione 500 µL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cada poço de uma placa de 6 poços. Coloque as MNs carregadas com 3BDO em cada poço, de modo que entrem em contato com o PBS.</li>
		<li>Incube as placas à temperatura ambiente (RT). Em cada ponto de tempo, colete 500 µL de PBS para quantificação da concentração de 3BDO.</li>
		<li>Reponha imediatamente cada poço com 500 µL de PBS fresco para manter condições de sumidouro.</li>
		<li>Calcule a porcentagem cumulativa de 3BDO liberado com base na carga total de fármaco inicialmente presente nas MNs.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ensaios antibacterianos
	<ol>
		<li>Retire as culturas bacterianas armazenadas (E. coli e Staphylococcus aureus) do congelador a -80 °C e adicione 10 µL de cada cultura a 5 mL de meio LB.</li>
		<li>Incube o meio inoculado em agitador incubado a 37 °C e 250 rpm por aproximadamente 16 h (durante a noite).</li>
		<li>Ajuste a cultura bacteriana com meio LB para uma OD620 inicial de 0,01.</li>
		<li>Dilua a solução estoque de CS com água estéril para preparar soluções de CS em seis concentrações (1, 5, 10, 50, 100 e 500 mg/mL), com três repetições para cada concentração.</li>
		<li>Divida as amostras em três grupos: grupo branco, grupo controle e grupo CS. Para o grupo branco, adicione 200 µL de LB. Para o grupo controle, adicione 180 µL de solução bacteriana e 20 µL de água estéril. Para o grupo CS, adicione 180 µL de solução bacteriana e 20 µL da concentração correspondente de solução de CS.</li>
		<li>Incube a 37 °C por 20 h.</li>
		<li>Meça e registre a OD620 de cada poço da placa de 96 poços em um leitor de placas de absorvância no tempo 0 h e 20 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Avaliações de citotoxicidade
	<ol>
		<li>Plante 100 µL de suspensão de células epidérmicas ou dérmicas em uma placa de 96 poços (2 × 103 células por poço).</li>
		<li>Adicione 10 µL dos respectivos tratamentos aos poços designados para estabelecer quatro grupos: um grupo controle (meio de cultura), um grupo 3BDO (concentração final de 1 µM), um grupo extrato de MN e um grupo 3BDO+extrato de MN, com 3 repetições para cada grupo.</li>
		<li>Incube a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h.</li>
		<li>Adicione 10 µL de solução de trabalho do Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8) a cada poço. 
		NOTA: Evite formar bolhas nos poços, pois elas podem afetar as leituras de absorvância.</li>
		<li>Incube a 37 °C, 5% CO₂ por 2 h.</li>
		<li>Leia a absorvância em 450 nm em todos os poços utilizando um espectrofotômetro de microplacas.</li>
		<li>Analise os dados e calcule a taxa de sobrevivência celular.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Experimentos com animais
<ol>
	<li>Preparação e tratamento do animal experimental
	<ol>
		<li>Anestesiar camundongos machos C57BL/6 de 7 semanas de idade com isoflurano e manter a termorregulação durante a anestesia. 
		CAUTION: O isoflurano é um anestésico volátil. Operar em ambiente bem ventilado para evitar inalação excessiva.</li>
		<li>Aplicar lubrificante oftálmico nos olhos dos camundongos para protegê-los da dessecação.</li>
		<li>Depilar os pelos da região dorsal dos camundongos com uma máquina elétrica, deixando uma área depilada de aproximadamente 2 × 2 cm2.</li>
		<li>Aplicar o creme depilatório, aguardar 5–10 s e, em seguida, removê-lo com um lenço. Limpar a pele com um cotonete umedecido em solução salina para remover qualquer resíduo de creme depilatório e pelos.</li>
		<li>Recortar os patches de microagulhas (MN) e reservá-los.</li>
		<li>Dividir aleatoriamente os camundongos depilados em cinco grupos (n = 5 por grupo) e tratar conforme a seguir:
		<ol>
			<li>Grupo controle não tratado: apenas depilar os pelos, sem nenhum tratamento adicional.</li>
			<li>Grupo com patch de MN vazio: tratar a pele depilada com patches de MN sem 3BDO, seguindo o mesmo cronograma do grupo 3BDO@MN.</li>
			<li>Grupo com patch 3BDO@MN: tratar a pele depilada com patches de 3BDO@MN nos dias 1, 3, 5, 7, 9, 11 e 13.</li>
			<li>Grupo com injeção subcutânea de PBS: administrar injeção subcutânea de solução PBS na região dorsal depilada dos camundongos diariamente.</li>
			<li>Grupo com injeção subcutânea de 3BDO: administrar injeção subcutânea de solução de 3BDO na região dorsal depilada dos camundongos diariamente.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Colocar os patches de 3BDO@MN sobre a pele depilada e aplicar pressão vertical uniforme para garantir a inserção das microagulhas na pele. Fixar os patches de 3BDO@MN com uma bandagem elástica e usar um prendedor reto para manter a bandagem no lugar. 
		&#8203;NOTE: Os diferentes esquemas de dosagem foram escolhidos com base nas características distintas de liberação de cada estratégia: o patch de 3BDO@MN proporciona liberação sustentada localizada, enquanto a injeção subcutânea libera o 3BDO como uma dose em bólus.</li>
		<li>Observar os camundongos durante todo o experimento para garantir que eles se recuperem completamente da anestesia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleta de amostras e avaliação do crescimento capilar
	<ol>
		<li>Fotografar a pele dorsal dos camundongos diariamente para registrar o crescimento dos pelos.</li>
		<li>Avaliar o crescimento dos pelos medindo o diâmetro do fio capilar, a cobertura capilar e a densidade capilar no dia 15. Quantificar a porcentagem de cobertura capilar na área tratada utilizando o software ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou C, Li X, Wang C, Zhang J. Alopecia areata: an update on etiopathogenesis, diagnosis, and management. Clin Rev Allergy Immunol. 2021;61(3):403-23.</li>
	<li>Rudnicka L. Hair loss is a symptom of many complex medical and psychological problems. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023;37(8):1460-1.</li>
	<li>Alessandrini A, Bruni F, Piraccini BM, Starace M. Common causes of hair loss: clinical manifestations, trichoscopy and therapy. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2021;35(3):629-40.</li>
	<li>Zhao X et al. Long noncoding RNA CA7-4 promotes autophagy and apoptosis via sponging MIR877-3P and MIR5680 in high glucose-induced vascular endothelial cells. Autophagy. 2020;16(1):70-85.</li>
	<li>Wang L et al. An effective pharmacological hydrogel induces optic nerve repair and improves visual function. Sci China Life Sci. 2024;67(3):529-42.</li>
	<li>Wei Y et al. Midline-1 regulates effector T cell motility in experimental autoimmune encephalomyelitis via mTOR/microtubule pathway. Theranostics. 2024;14(3):1168-80.</li>
	<li>Gao Y et al. Rheb1 promotes tumor progression through mTORC1 in MLL-AF9-initiated murine acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 2016;9:36.</li>
	<li>Wei L et al. A butyrolactone derivative 3BDO alleviates memory deficits and reduces amyloid-beta deposition in an AbetaPP/PS1 transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 2012;30(3):531-43.</li>
	<li>Meng N et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein E1 regulates protein disulphide isomerase translation in oxidized low-density lipoprotein-activated endothelial cells. Acta Physiol (Oxf). 2015;213(3):664-75.</li>
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	<li>Yang CC, Cotsarelis G. Review of hair follicle dermal cells. J Dermatol Sci. 2010;57(1):2-11.</li>
	<li>Jin Y et al. Multifunctional microneedle patches loaded with engineered nitric oxide-releasing nanocarriers for targeted and synergistic chronic wound therapy. Adv Mater. 2025;37(5):e2413108.</li>
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	<li>Cao Y et al. Dissolvable microneedle-based wound dressing transdermally and continuously delivers anti-inflammatory and pro-angiogenic exosomes for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2024;42:32-51.</li>
	<li>Liu J et al. Medium-molecular weight hyaluronic acid orchestrates hair follicle regeneration via CD44/AKT-driven endogenous ROS activation of beta-catenin. Int J Biol Macromol. 2026;360:151752. doi:10.1016/j.ijbiomac.2026.151752.</li>
	<li>Nareswari A et al. Development and validation of a C57BL/6 mouse model of androgenetic alopecia through testosterone propionate induction. Trends Sci. 2026;23(8):12711.</li>
	<li>Liu M, He G, Wang F, Wang Y. In vivo non-invasive observation of dynamic changes in hair shaft, melanin, and collagen during the C57BL/6 follicle cycle. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.09.15.676351.</li>
	<li>Vora LK et al. Long-acting microneedle formulations. Adv Drug Deliv Rev. 2023;201:115055.</li>
	<li>Xiang H et al. Dissolving microneedles for alopecia treatment. Colloids Surf B Biointerfaces. 2023;229:113475.</li>
	<li>Xiao T et al. Microneedle assisted delivery of epidermal and dermal stem cells to promote hair growth. J Mater Sci. 2024;59(19):8427-40.</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Atualmente, os tratamentos clínicos para a AAG são principalmente classificados em intervenções farmacológicas e transplante cirúrgico. Neste estudo, os MNs carregados com 3BDO promoveram o crescimento capilar em um modelo de camundongo C57BL/6. No entanto, os métodos convencionais de administração de fármacos apresentam limitações, como distribuição desigual do medicamento. O protocolo principal deste estudo é um método em duas etapas para fabricar MNs carregados com 3BDO. O AH e o CS são os componentes principais dos MNs. Várias etapas críticas exigem atenção para garantir a qualidade dos MNs.
Primeiro, para evitar a formação de bolhas de ar na solução polimérica, utilizou-se um molde pré-resfriado para retardar a evaporação do solvente durante a centrifugação. Segundo, as condições de secagem afetam diretamente a fragilidade da ponta e a integridade da camada de suporte. Secagem por 16 h a 36 &#176;C com umidade controlada ajudou a garantir pontas com resistência mecânica suficiente, ao mesmo tempo em que manteve a flexibilidade da camada de suporte, evitando a secagem excessiva. Terceiro, uma velocidade de 134 &#215; g por 5 min concentra efetivamente o 3BDO na região da ponta, mas velocidades mais altas ou tempos mais longos podem causar precipitação do fármaco na base da matriz, reduzindo a eficiência de entrega. Para o in vivo ensaio, camundongos C57BL/6 foram utilizados como modelo de regeneração capilar. Os folículos pilosos de camundongos C57BL/6 exibem um ciclo de crescimento capilar visível e altamente sincronizado, o que oferece conveniência experimental e os torna um dos modelos mais comuns para o estudo de doenças cutâneas¹⁶. Aproximadamente aos 7 semanas de idade, os folículos pilosos de camundongos C57BL/6 entram naturalmente na fase telógena. Após a depilação artificial dos camundongos, os folículos pilosos reentram imediatamente na fase anágena17. O in vivo ensaio mostrou que o sistema MN promoveu um crescimento capilar mais uniforme do que a injeção subcutânea neste modelo.
O sistema 3BDO@MN pode representar uma estratégia pré-clínica promissora para o tratamento da queda de cabelo, integrando uma molécula pequena regeneradora capilar com uma plataforma de liberação transdérmica minimamente invasiva. Formulações de microneedles de ação prolongada já demonstraram permitir a liberação controlada ou sustentada de fármacos, reduzir a frequência de administração e melhorar a adesão do paciente, superando algumas limitações associadas aos tratamentos tópicos ou sistêmicos convencionais18,19. Além disso, estratégias recentes de regeneração capilar assistidas por microneedles, incluindo a entrega de células-tronco, reforçam ainda mais a aplicabilidade mais ampla das plataformas de microneedles nesta área20. Contudo, antes da translação clínica, ainda são necessários estudos adicionais para avaliar a biossegurança de longo prazo, perfis farmacocinéticos/farmacodinâmicos, otimização de dose, estabilidade durante o armazenamento e produção em larga escala.

A alopecia androgenética (AGA) é uma das doenças clínicas de queda de cabelo mais comuns, caracterizada principalmente pelo afinamento progressivo e perda de cabelo no couro cabeludo. Sua prevalência ao longo da vida permanece persistentemente alta entre homens, tornando-a um problema de saúde crítico que exige resolução urgente1,2. Atualmente, os tratamentos clínicos para a AGA são principalmente classificados em intervenções farmacológicas e transplante cirúrgico, ambos com desvantagens significativas. Fármacos terapêuticos de primeira linha, como finasterida e minoxidil, apresentam certos efeitos terapêuticos, mas estão associados a reações adversas definidas, como disfunção sexual, prurido no couro cabeludo e ressecamento do couro cabeludo1,3. Embora o transplante capilar possa promover a regeneração local do cabelo, ele é limitado por altos custos de tratamento, quantidade insuficiente de cabelo nas áreas doadoras e taxas variáveis de sobrevivência dos enxertos, dificultando sua ampla popularização na prática clínica1. Diante dessas limitações, há necessidade de novas estratégias terapêuticas que combinem eficácia, segurança e adesão do paciente.
O 3BDO é um ativador de molécula pequena da mTOR que compete com a rapamicina4. Tem sido amplamente utilizado como inibidor da autofagia em diversos sistemas5,6,7. Por exemplo, o tratamento de longo prazo com 3BDO pode melhorar a função da memória ao reduzir o número de autofagossomos8. Além disso, evidências crescentes sugerem que o 3BDO pode atuar independentemente como ativador da mTOR. Por exemplo, o 3BDO impediu a morte de células endoteliais e o desenvolvimento da aterosclerose em camundongos, independentemente da atividade da mTOR9. No entanto, seu possível papel no crescimento do folículo piloso ainda não foi relatado. Notavelmente, em nossos estudos preliminares, observou-se que o 3BDO promove o crescimento de novos pelos. Contudo, os métodos tradicionais de administração tópica de fármacos apresentam limitações evidentes. A camada córnea da pele limita a eficiência transdérmica, dificultando a entrega de medicamentos ao sítio-alvo nos folículos pilosos na derme. Embora géis transdérmicos possam prolongar o tempo de retenção do fármaco, podem deixar resíduos indesejáveis. A eficácia clínica de ambas as estratégias de tratamento mencionadas acima permanece subótima10,11.
As microneedles (MNs) são uma tecnologia inovadora e indolor de administração de fármacos cuja principal vantagem reside na sua capacidade de penetrar facilmente o estrato córneo e entregar com precisão medicamentos ao microambiente perifolicular na junção entre a epiderme e a derme. Além disso, as MNs apresentam uso conveniente, mínima invasividade e custo razoável12,13,14. Para superar o gargalo da entrega transdérmica do 3BDO tópico, foi desenvolvido um curativo com microneedles utilizando ácido hialurônico (HA) como matriz e quitosana (CS) como componente funcional. A incorporação de CS tem como objetivo fornecer um componente funcional com potencial antibacteriano. Além disso, a aplicação de HA na pele de camundongos alopecicos pode estimular significativamente o desenvolvimento dos folículos pilosos15. Portanto, este protocolo descreve a fabricação e caracterização de um sistema de MNs dissolúveis carregadas com 3BDO e sua aplicação em um modelo de regeneração capilar em camundongos C57BL/6 depilados. Esse modelo é útil para avaliar as respostas de regeneração capilar após a depilação, mas por si só não estabelece eficácia clínica para a AAG.

<table><tbody><tr><td>3BDO</td><td>Yuanye Bio-Technology Co., Xangai, China</td><td>890405-51-3</td><td>Preparação da formulação CS/HA carregada com 3BDO</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning Incorporated, EUA</td><td>REF 3516</td><td>ensaio antibacteriano e ensaio de liberação de fármaco in vitro</td></tr><tr><td>Etanol 75%</td><td>Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.</td><td>1202050004</td><td>Desinfecção</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning Incorporated, EUA</td><td>REF3599</td><td>avaliações de citotoxicidade celular e ensaio antibacteriano</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories</td><td>7 semanas</td><td>experimentos com animais</td></tr><tr><td>Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8)</td><td>Dojindo, Japão</td><td>CK04</td><td>avaliações de citotoxicidade</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75007204</td><td>centrífuga para formulação</td></tr><tr><td>Quitosana (CS)&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd</td><td>9012-76-4</td><td>Preparação da formulação CS/HA</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Veet</td><td>3059944023307</td><td>Depilação</td></tr><tr><td>Dissulfóxido de dimetila (DMSO)</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd</td><td>67-68-5</td><td>Preparação da formulação CS/HA carregada com 3BDO</td></tr><tr><td>Balança eletrônica</td><td>Radwag</td><td>AS 220.R2</td><td>Pesagem de pó</td></tr><tr><td>Escherichia coli (E. coli)</td><td>ATCC</td><td>/</td><td>ensaio antibacteriano</td></tr><tr><td>Ácido hialurônico (HA) em pó</td><td>Bloomage Biotechnology Co. China</td><td>9067-32-7</td><td>Preparação da formulação CS/HA</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Institutos Nacionais de Saúde</td><td>/</td><td>Análise estatística</td></tr><tr><td>Agitador-incubadora</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>50163013</td><td>incubação bacteriana</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Gene&amp;amp;I</td><td>AMS</td><td>anestesia animal</td></tr><tr><td>Meio LB</td><td>Sigma Life Science</td><td>L3022</td><td>ensaio antibacteriano</td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Hangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.</td><td>SP-16</td><td>Agitação da formulação</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro microplaca Multiskan SkyHigh</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>/</td><td>Medição de OD</td></tr><tr><td>Estufa</td><td>Shanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,Ltd</td><td>DHG-9260A</td><td>Secagem de microneedles</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Amcor&amp;nbsp;</td><td>PM-996</td><td>vedação de microneedles</td></tr><tr><td>Solução tampão fosfato (PBS)</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td>ensaio de liberação de fármaco in vitro</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus (S. aureus)</td><td>ATCC</td><td>/</td><td>ensaio antibacteriano</td></tr><tr><td>Analisador universal de textura TA</td><td>Shanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd</td><td>/</td><td>Teste de resistência mecânica</td></tr><tr><td>Câmara de vácuo</td><td>Shanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,Ltd</td><td>DZF-6050</td><td>Secagem a vácuo</td></tr></tbody></table>

fabricação e caracterização de adesivos de microagulhas dissolvíveis carregados com 3bdo para recrescimento capilar em camundongos c57bl/6

Fabrication and Characterization of 3BDO-Loaded Dissolvable Microneedle Patches for Hair Regrowth in C57BL/6 Mice

Os tratamentos convencionais para a alopecia androgenética (AA) apresentam limitações, o que motiva abordagens alternativas de administração. Este protocolo descreve a fabricação, caracterização e aplicação de microagulhas solúveis carregadas com 3BDO, compostas por ácido hialurônico/quitosana (HA/CS), em um modelo de regeneração capilar em camundongos C57BL/6. O método utiliza um processo de moldagem em duas etapas em um molde de polidimetilsiloxano (PDMS) para concentrar o 3BDO nas pontas das microagulhas, ao mesmo tempo em que forma uma camada de suporte de HA/CS sem fármaco. O curativo é caracterizado por meio de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV), testes mecânicos, testes de inserção e dissolução na pele, testes de liberação in vitro, ensaios antibacterianos, testes de citotoxicidade e avaliação in vivo da regeneração capilar. Após a inserção, as pontas das microagulhas se dissolvem, liberando o 3BDO localmente. A avaliação in vivo mostrou que o grupo tratado com microagulhas carregadas com 3BDO apresentou uma regeneração capilar mais uniforme em comparação com os grupos submetidos à injeção subcutânea e ao grupo controle. Este protocolo também permite a avaliação da morfologia do curativo, do desempenho na inserção e da biocompatibilidade local. Este método fornece um fluxo de trabalho pré-clínico para avaliar a administração mediada por microagulhas do 3BDO em aplicações de regeneração capilar.

Este protocolo apresenta a fabricação e caracterização do curativo 3BDO@MN. Figura 1 mostra o esquema do processo de fabricação do curativo 3BDO@MN. O 3BDO foi misturado na formulação de CS/HA, e a mistura da matriz foi então adicionada à matriz de MN de PDMS e centrifugada para preencher as pontas das agulhas. A mistura da matriz de CS/HA sem 3BDO foi adicionada à superfície da matriz e centrifugada para preencher a camada de suporte. Após secagem completa, os curativos foram destacados para obter os curativos 3BDO@MN. A morfologia das MNs foi caracterizada por MEV, conforme mostrado na Figura 2A.
As MNs cônicas foram formadas uniformemente em um arranjo 20 × 20 em um curativo de 15 × 15 mm, cada uma com largura da base de 250 µm e altura de 600 µm. As pontas das MNs resistiram a uma força de 1,2 N, suficiente para penetração na pele, conforme evidenciado por orifícios claros de inserção observados por meio de coloração com hematoxilina e eosina (H&amp;E) (Figura 2B,C). A pele dorsal de camundongo foi então utilizada para testar a aplicação de curativos com 3BDO@MN. Os curativos foram pressionados contra a pele do camundongo para medir o tempo de dissolução, e as pontas das MNs se dissolveram completamente em até 60 s (Figura 2D). No ensaio in vitro, o perfil de liberação do 3BDO a partir das MNs mostrou que aproximadamente 90% do fármaco foi liberado (Figura 2E). O extrato das MNs não apresentou citotoxicidade em células epidérmicas e dérmicas, enquanto 1 µM de 3BDO promoveu significativamente o crescimento celular (Figura 2F). A formulação contendo quitosana demonstrou atividade antibacteriana dependente da concentração contra E. coli e S. aureus, com efeito mais acentuado em concentrações superiores a 10 mg/mL (Figura 2G,H). Esses resultados apoiam o uso da quitosana como componente funcional da formulação das MNs, embora testes adicionais dos curativos fabricados sejam necessários para confirmar o desempenho antibacteriano em condições de aplicação.
Os resultados experimentais com animais demonstraram que o grupo 3BDO@MN exibiu pigmentação significativa da pele no dia 5. No dia 15, o grupo que recebeu injeções de 3BDO apresentou cerca de 45% de cobertura capilar, em comparação com aproximadamente 39% no grupo controle, enquanto o grupo 3BDO@MN alcançou cerca de 90% de cobertura (Figura 3). O crescimento capilar no grupo 3BDO@MN foi mais uniforme e denso, indicando melhor penetração e retenção do fármaco em comparação com a injeção direta.
Em conjunto, esses achados indicam que a entrega mediada por MN de 3BDO promoveu o crescimento capilar no modelo de camundongo C57BL/6 despilado utilizado neste estudo. São necessários estudos adicionais para determinar se essa abordagem é eficaz em modelos específicos de alopecia androgenética e sob condições de dosagem clinicamente relevantes.
<img alt="Diagrama do processo de bioimpressão 3D: revestimento 3BDOQCS/HA, centrífuga, secagem a vácuo, matriz CS/HA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Ilustração esquemática do processo de fabricação dos 3BDO@MNs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagramas de matriz de microneedles e gráficos de viabilidade celular; estudo sobre as propriedades antibacterianas do lactato de quitosana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Fabricação e caracterização do sistema 3BDO@MN. (A) Imagem de MEV mostrando a morfologia dos 3BDO@MN. Barra de escala = 500 µm. (B) Curva força-deslocamento dos 3BDO@MN. (C) Seção transversal de pele de camundongo corada com H&amp;E após inserção dos 3BDO@MN e remoção da base, confirmando a penetração bem-sucedida no tecido. Barra de escala = 100 µm. (D) Imagens de MEV mostrando a dissolução dos MNs aos 5 s, 10 s, 30 s e 60 s após a inserção na pele. (E) Perfil cumulativo in vitro de liberação do 3BDO a partir dos MNs. (F) Viabilidade celular de células epidérmicas e células dérmicas tratadas com 3BDO, extrato de MN e extrato de MN contendo 3BDO após 24 h. (G,H) Absorbância em 620 nm das suspensões de (G) Staphylococcus aureus e (H) Escherichia coli cultivadas em meio contendo quitosana em diferentes concentrações. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3), e a significância estatística foi analisada por ANOVA a um critério (**p &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Experimento de crescimento capilar com patches de microagulhas (MNs); resultados de pigmentação e cobertura capilar em camundongos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Efeitos do 3BDO@MNs na regeneração capilar in vivo. (A) Ilustração esquemática dos experimentos com animais. (B) Imagens representativas da pele dorsal de camundongos no dia 0 (aparado), dia 5, dia 10 e dia 15 após o tratamento. (C) Análise quantitativa dos escores de pigmentação (unidades arbitrárias) em (B). (D) Análise quantitativa da área de cobertura capilar (%) na região tratada em (B). (E) Mudança relativa da área de cobertura capilar na região tratada em comparação com o grupo controle. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 5) e a significância estatística foi analisada por ANOVA unidirecional (**p &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve a fabricação, caracterização e aplicação de patches de microneedles carregados com 3BDO e de dissolução rápida para administração transdérmica de fármacos em um modelo de regeneração capilar em camundongo.

Fabricação e Caracterização de Adesivos de Microagulhas Dissolvíveis Carregados com 3BDO para Recrescimento Capilar em Camundongos C57BL/6

Os tratamentos convencionais para a alopecia androgenética (AGA) apresentam limitações, motivando a busca por abordagens alternativas de entrega. Este protocolo descreve o...

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Research

JoVE Journal

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