Name: Imagens de células vivas e rastreamento de células únicas para monitorar dinâmicas clonais e transições de destino em organoides intestinais humanos e murinos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda a realizar imagens de células vivas e rastreamento de células únicas em organoides intestinais humanos e murinos. Este método permite monitorar dinâmicas clonais e transições de destino celular em tempo real com resolução de célula única.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Barker N, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003-7.</li>
	<li>Clevers H. Shifting paradigms in tissue stem cell biology: insights from the intestine. Cell. 2026;189(3):706-24.</li>
	<li>Betjes MA, Kok RNU, Tans SJ, van Zon JS. Cell tracking with accurate error prediction. Nat Methods. 2025;22(11):2400-10.</li>
	<li>Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459(7244):262-5.</li>
	<li>Sato T, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#39;s epithelium. Gastroenterology. 2011;141(5):1762-72.</li>
	<li>He GW, et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of Paneth cell formation. Cell Stem Cell. 2022;29(9):1333-45.e6.</li>
	<li>Artegiani B, et al. Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR-Cas9 precision genome editing. Nat Cell Biol. 2020;22(3):321-31.</li>
	<li>Celotti M, et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation CRISPR tools. STAR Protoc. 2024;5(3):103189.</li>
	<li>Krueger D, et al. Epithelial tension controls intestinal cell extrusion. Science. 2025;389(6764).</li>
	<li>Buissant des Amorie JR, et al. Intestinal tuft cell subtypes represent successive stages of maturation driven by crypt-villus signaling gradients. Nat Commun. 2025;16(1):6765.</li>
	<li>Huang L, et al. Tuft cells act as regenerative stem cells in the human intestine. Nature. 2024;634(8035):929-35.</li>
	<li>Wang D, et al. Interferon-responsive intestinal BEST4/CA7+ cells are targets of bacterial diarrheal toxins. Cell Stem Cell. 2025;32(4):598-612.e5.</li>
	<li>Jain A, et al. Morphodynamics of human early brain organoid development. Nature. 2025;644(8078):1010-9.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, van Rheenen J, Suijkerbuijk SJE. Generation of mixed murine organoids to model cellular interactions. STAR Protoc. 2021;2(4):100997.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, et al. Active elimination of intestinal cells drives oncogenic growth in organoids. Cell Rep. 2021;36(1):109307.</li>
	<li>Serra D, et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 2019;569(7754):66-72.</li>
	<li>de Medeiros G, et al. Multiscale light-sheet organoid imaging framework. Nat Commun. 2022;13(1):4864.</li>
	<li>Huelsz-Prince G, et al. Mother cells control daughter cell proliferation in intestinal organoids to minimize proliferation fluctuations. eLife. 2022;11.</li>
	<li>Zheng X, et al. Organoid cell fate dynamics in space and time. Sci Adv. 2023;9(33).</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Live cell imaging of mouse intestinal organoids reveals heterogeneity in their oxygenation. Biomaterials. 2017;146:86-96.</li>
	<li>Gros A, et al. A quantitative pipeline for whole-mount deep imaging and analysis of multi-layered organoids across scales. eLife. 2026;14.</li>
	<li>Nagarajan S, Naganathan SR. Pushing the limits of automated cell tracking. Nat Methods. 2025;22(11):2236-8.</li>
	<li>Kok RNU, et al. OrganoidTracker: efficient cell tracking using machine learning and manual error correction. PLoS One. 2020;15(10).</li>
	<li>Martinez-Silgado A, et al. Differentiation and CRISPR-Cas9-mediated genetic engineering of human intestinal organoids. STAR Protoc. 2022;3(3):101639.</li>
	<li>van der Linden FH, Okkelman IA, Ioannou M, Dmitriev RI. A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium. Nat Commun. 2021;12(1):7159.</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Extracellular Ca2+-sensing fluorescent protein biosensor based on a collagen-binding domain. ACS Appl Bio Mater. 2020;3(8):5310-21.</li>
	<li>Nguyen NTB, et al. Lactate controls cancer stemness and plasticity through epigenetic regulation. Cell Metab. 2025;37(4):903-19.e10.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um)&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>with climate control for temperature and CO2</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>far-red live-cell nuclear dye</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR&nbsp;</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>far-red live-cell DNA dye</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitor)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;custom order</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>homemade</td><td></td><td>The production of Wnt3A conditioned medium can be found here:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens de células vivas e rastreamento de células únicas para monitorar dinâmicas clonais e transições de destino em organoides intestinais humanos e murinos

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

Imagens de células vivas e rastreamento de células únicas para monitorar dinâmicas clonais e transições de destino em organoides intestinais humanos e murinos

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

Nossa pesquisa concentra-se em estudar como as células individuais tomam decisões sobre seu destino e coordenam seus comportamentos dentro do epitélio intestinal autorrenovável. A microscopia de luz não consegue resolver um marcador ubíquo, por exemplo, o compartimento da membrana de uma célula ou o citoesqueleto, e atribuí-lo efetivamente a uma célula ou a suas vizinhas. No entanto, organoides em mosaico podem realmente ajudar a superar essa limitação.Para começar, obtenha os reagentes necessários e linhagens validadas de organoides intestinais fluorescentes de camundongo e humano. Passe ambas as linhagens de organoides para meio condicionado com Wnt três dias antes da geração de organoides em mosaico para promover a expansão das células-tronco e maximizar a viabilidade celular durante a dissociação. Prepare BME a 5% em DMEM. Revesta cada poço de uma placa de 48 poços com 20 microlitros do BME preparado para fornecer uma camada adesiva fina para adesão celular e, em seguida, incube a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, dissolva o BME adicionando meio-base gelado. Colete os organoides de cada linhagem separadamente por centrifugação a 300 g durante cinco minutos a 4 graus Celsius. Dissocie os organoides em células individuais incubando-os em uma solução enzimática de desanexação celular por 5 a sete minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Usando uma pipeta P1000, pipete repetidamente a suspensão para auxiliar na dissociação mecânica. Monitore a dissociação em microscópio de campo claro. Interrompa a reação adicionando meio-base gelado em excesso quando predominantemente células individuais ou pequenos fragmentos de organoides de 2 a 10 células forem visíveis. Em seguida, forme um pellet celular por centrifugação a 300 g durante cinco minutos a 4 graus Celsius. Avalie a viabilidade celular e conte as células viáveis utilizando exclusão com azul de tripano. Combine as duas populações celulares na proporção desejada para obter um total de 300.000 células em 500 microlitros de meio condicionado com Wnt, suplementado com 10 micromolar de di-hidrocloreto de Y-27632 para organoides em mosaico de camundongo ou meio de expansão humano para culturas de organoides em mosaico humanos. Misture bem por pipetagem suave. Em seguida, remova o meio de revestimento das placas de 48 poços e semeie a suspensão celular nos poços revestidos. Centrifugue a placa a 200 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e incube a 37 graus Celsius. Prepare uma ponteira de pipeta P200 dobrando-a. Após 24 horas, desanexe mecanicamente a camada celular raspando com a ponteira dobrada e, em seguida, lave completamente com meio-base gelado. Colete os agregados desanexados por centrifugação a 300 g durante três minutos a 4 graus Celsius, sem cisalhamento mecânico adicional. Re-suspenda os agregados em BME e plaque-os em suportes amostrais compatíveis com imagem. Cultive os agregados plaqueados em meio ENR para organoides de camundongo e meio de expansão humano para organoides em mosaico humanos.Utilize câmaras de imagem com fundo de vidro para garantir compatibilidade óptica com objetivas confocais de alta abertura numérica. Plaque a suspensão de organoides em Matriz de Bases Extracelulares (BME) como uma cúpula fina próxima ao centro do fundo de vidro. Incube a placa a 4 graus Celsius por 5 a 10 minutos para permitir que os organoides afundem em direção ao fundo de vidro pela força da gravidade. Transfira a placa para 37 graus Celsius e deixe a BME solidificar por 20 a 30 minutos. Adicione 500 microlitros de meio de crescimento pré-aquecido a cada poço. Deixe os organoides se recuperarem e estabelecerem sua morfologia por pelo menos 24 horas antes de iniciar a aquisição de imagens em tempo real. Adquira imagens de lapso de tempo de longa duração e realize o rastreamento de células individuais e a reconstrução de linhagens celulares para análises posteriores.A formação bem-sucedida de mosaico foi caracterizada por uma distribuição do tipo sal e pimenta ou por fronteiras definidas entre as duas populações, dependendo do grau de dissociação utilizado. A dissociação completa em células isoladas produziu mosaicos do tipo sal e pimenta, enquanto a fragmentação suave preservou pequenos aglomerados clonais. Quando uma célula individual, coexpressando um marcador de interesse, é cercada por vizinhas não marcadas, suas dinâmicas do citoesqueleto durante migração, divisão ou extrusão podem ser atribuídas inequivocamente a essa célula. Marcadores nucleares de H2B facilitaram a identificação de constelações celulares informativas dentro do mosaico, e medições por célula, como taxa de divisão ao longo da vida e dinâmica da intensidade do marcador, foram extraídas dos dados de rastreamento. Células caliciformes ativaram e mantiveram uma expressão elevada de MUC2-mNeonGreen durante todo o período de imagem, enquanto células de Paneth exibiram ativação inicial de MUC2-mNeonGreen seguida por diminuição progressiva do sinal e subsequente ativação de DEFA5-dsRed. A quantificação em nível de célula única confirmou essa transição sequencial ao nível de células individuais. Curvas médias de intensidade em múltiplas células rastreadas confirmaram que esse padrão foi consistente ao nível populacional, com precursores de células de Paneth exibindo uma relação inversa característica entre os sinais de MUC2-mNeonGreen e DEFA5-dsRed.Este protocolo permite aos pesquisadores estudar como uma célula individual remodela seu citoesqueleto, por exemplo, durante a divisão, durante a migração ou, por exemplo, durante a extrusão em um tecido intacto. A consideração importante é a escolha da razão de marcação, pois células repórter esparsas isolam sinais de células individuais, enquanto células não marcadas esparsas revelam as respostas do entorno. Estudos futuros podem combinar repórteres de destino celular com marcação em mosaico em um único organoide para vincular compromissos de destino às dinâmicas do citoesqueleto em nível de célula única.

live-cell-imaging-single-cell-tracking-to-monitor-clonal-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Protocolos para cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), transfecção transitória de marcadores marcados com fluorescência de crescimento de microtúbulos, imagens de células vivas e análise automatizada da dinâmica de crescimento de microtúbulos interfásicos são detalhados.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Apresentamos um método para a aquisição de cursos de tempo de repórter fluorescência de células únicas usando matrizes micropatteradas. O protocolo descreve a preparação de matrizes unicelulares, a configuração e o funcionamento de microscopia de lapso de tempo de varredura de células vivas e uma ferramenta de análise de imagem de código aberto para pré-seleção automatizada, controle visual e rastreamento de cursos de tempo de fluorescência integrados por células por local de adesão.

Imagem de células vivas de matrizes unicelulares (LISCA) - uma técnica versátil para quantificar cinética celular

O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.

Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

Aprenda a realizar imagens de células vivas e rastreamento de células únicas em organoides intestinais humanos e murinos. Este método permite monitorar dinâmicas clonais e transições de destino celular em tempo real com resolução de célula única.

Imagens de células vivas e rastreamento de células únicas para monitorar dinâmicas clonais e transições de destino em organoides intestinais humanos e murinos (Vídeo) | JoVE Journal

Imagens de células vivas e rastreamento de células únicas para monitorar dinâmicas clonais e transições de destino em organoides intestinais humanos e murinos

Explorar mais vídeos