Name: Medindo a Reparo de Quebras Dupla-Fita do DNA Utilizando o Ensaio DR-white em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda o ensaio DR-white para medir reparo de quebras dupla-fita do DNA em Drosophila melanogaster. Este método distingue entre recombinação homóloga, NHEJ e anelamento de fita simples em organismos multicelulares.

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Este método foi desenvolvido enquanto J.R.L. era beneficiário de uma bolsa de pesquisa da AFAR (American Federation for Aging Research).&#160;Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (1R15GM110454 e 1R15GM129628) concedido a J.R.L. As figuras foram elaboradas com a ajuda do BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

1. Ensaio DR-white
<ol>
	<li> Cruzamentos genéticos (Figura 3A) 
	NOTA: Para protocolos padrão de cultivo e genética de Drosophila, consulte &#34;Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics&#34; por Ralph J. Greenspan17. As informações sobre genótipos das linhagens estão fornecidas na Tabela de Materiais.
	<ol>
		<li>Mantenha as moscas a 25 °C com ciclos de 12 h luz/escuro em alimento padrão para Drosophila, polvilhado com levedura ativa.</li>
		<li>Monte cinco frascos para choque térmico cruzando 8–10 fêmeas virgens DR-white com 3–5 machos portadores de um transgene I-SceI (Cruzamento 1, Figura 3A) por frasco. 
		NOTA: Diferentes transgenes I-SceI podem ser utilizados dependendo da aplicação. Neste protocolo, o transgene hsp70-I-SceI foi utilizado para indução por choque térmico11. Para evitar expressão vazia de I-SceI em gerações anteriores, é importante garantir que os transgenes DR-white e I-SceI sejam combinados na mesma mosca apenas nesta geração.</li>
		<li>No mesmo dia, monte frascos de ampliação de uma linhagem y w. Estas serão as moscas-teste. Três frascos de ampliação são suficientes para aproximadamente 60–80 cruzamentos-teste.</li>
		<li>Cultive os frascos de choque térmico e os frascos de ampliação y w a 25 °C por 3 dias.</li>
		<li>No terceiro dia, transfira os frascos de choque térmico e os frascos de ampliação y w para alimento fresco para servir como conjunto reserva.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Choque térmico/indução de quebras de dupla fita (DSB) 
	NOTA: Se não estiver utilizando um transgene I-SceI induzível por choque térmico, pule para a etapa 1.2.5, que geralmente é realizada 3 dias após a etapa 1.1.5.
	<ol>
		<li>Envelheça os frascos de choque térmico por 3 h a 25 °C para garantir que toda a prole tenha passado pela transição materno-zigótica.</li>
		<li>Submeta os frascos originais a choque térmico em banho-maria a 38 °C por 1 h. Certifique-se de que o nível da água esteja pelo menos na altura da base da bola de algodão para que as larvas não subam acima da linha d’água.</li>
		<li>Monitore a temperatura do banho-maria a cada 15 min e mantenha-a dentro de 38 ± 0,5 °C, pois os resultados de indução e reparo dependem da duração e da temperatura do choque térmico.</li>
		<li>Retorne os frascos a 25 °C.</li>
		<li>No dia seguinte, adicione 1/3 de um papel toalha de laboratório dobrado ao alimento para absorver o excesso de umidade. Se o alimento estiver seco, adicione aproximadamente 100 µL de água ao papel toalha. Adicione uma bola de algodão aos frascos de ampliação y w.</li>
		<li>Cultive os frascos submetidos ao choque térmico por mais 6 dias a 25 °C, ou até que as moscas comecem a emergir.</li>
		<li>Descarte os frascos reserva e os frascos de ampliação 3 dias após a transferência. Adicione uma bola de algodão aos frascos de ampliação y w reserva aproximadamente 4 dias após o descarte. 
		NOTA: Se necessário, os frascos reserva podem ser submetidos ao choque térmico conforme as etapas 1.2.1 a 1.2.6 e processados conforme descrito abaixo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cruzamentos-teste
	<ol>
		<li>Colete moscas submetidas ao choque térmico portadoras dos transgenes DR-white e I-SceI durante 4–5 dias após o início da emergência para reduzir o viés de estágio de desenvolvimento. 
		NOTA: Moscas submetidas com sucesso ao choque térmico portadoras dos transgenes DR-white e I-SceI apresentam olhos em mosaico devido a eventos de reparo embrionários e larvais que se desenvolveram em tecidos adultos. O grau de mosaicismo nem sempre está correlacionado com eventos de reparo na linhagem germinativa e, portanto, não deve ser um fator determinante na seleção de moscas experimentais para cruzamentos-teste (etapa 1.3.3).</li>
		<li>Colete fêmeas virgens y w durante 5 dias. Colete 5 fêmeas virgens por número esperado de amostras. Colete dos frascos de ampliação reserva assim que começarem a emergir.</li>
		<li>Monte os frascos-teste cruzando um macho submetido ao choque térmico com 4–5 fêmeas virgens y w (Cruzamento 2; Figura 3A). Selecione machos aleatoriamente a partir do conjunto coletado na etapa 1.3.1 para reduzir o viés de estágio de desenvolvimento. Cultive os cruzamentos-teste a 25 °C. 
		NOTA: Para evitar a ocorrência de crossing over entre DR-white e I-SceI, geralmente analisa-se a linhagem germinativa de machos; no entanto, a prole fêmea também pode ser analisada. Se a prole fêmea for analisada, os frascos-teste do Cruzamento 2 são montados na proporção de 2 fêmeas:5 machos y w e cultivados por 5–6 dias (próxima etapa) para garantir produtividade.</li>
		<li>Verifique a produtividade 4 dias após montar os frascos-teste para avaliar quando devem ser descartados. 
		NOTA: Confirme que foram postos ovos suficientes para garantir pelo menos 20 descendentes analisáveis, mas evite o supercrescimento das culturas, pois as moscas podem ficar presas no alimento.</li>
		<li>Quando os frascos-teste estiverem prontos (até 4–5 dias após o estabelecimento dos cruzamentos-teste), descarte as moscas e adicione 1/3 de um papel toalha de laboratório dobrado ao alimento para absorver o excesso de umidade. 
		NOTA: Os machos podem ser coletados neste momento se análises adicionais (por exemplo, genotipagem molecular) forem necessárias.</li>
		<li>Cultive os frascos-teste por mais 5–6 dias a 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise fenotípica 
	NOTA: Aproximadamente 25 frascos-teste são montados para cada condição em cada experimento genético (por exemplo, mutantes homozigotos e controles heterozigotos). Cada experimento genético é repetido 2–3 vezes, e os dados individuais de cada frasco são agrupados.
	<ol>
		<li>Analise a prole do Cruzamento 2 (Figura 3A) por aproximadamente 9 dias após o início da emergência das primeiras moscas.</li>
		<li>Anestesie as moscas usando CO2 ou transferindo-as para um frasco vazio sem alimento e congelando a -20 °C por pelo menos 30 min. 
		NOTA: Se as moscas forem congeladas, podem ser analisadas até vários dias depois.</li>
		<li>Coloque as moscas em uma placa para moscas e analise os fenótipos apropriados (Figura 3A). Inclua apenas frascos com pelo menos 20 moscas analisadas no conjunto de dados.
		<ol>
			<li>Para análise, primeiro separe as moscas portadoras do cassete DR-white (utilizando fluorescência positiva para proteína fluorescente vermelha [RFP+] como marcador), depois analise a cor dos olhos e do corpo.</li>
			<li>O transgene y+ ligado ao cassete DR-white resulta em uma cor marrom intermediária do corpo que não é totalmente selvagem. Para distinguir entre ausência de DSB/NHEJ (corpo marrom;&#160;y+&#160;w-) e SSA (corpo amarelo;&#160;y-&#160;w-), compare as moscas com a prole y w que não possui o cromossomo DR-white (RFP-). Eventos de SSA terão a mesma coloração amarela dessas moscas. Classifique como ausência de DSB/NHEJ as moscas mais escuras (mais marrons) do que essas. 
			NOTA: Desvios dos fenótipos descritos na Figura 3A&#160;podem indicar contaminação, e o frasco não deve ser analisado. Embora moscas mortas inteiras possam ser analisadas, moscas danificadas devem ser descartadas se os fenótipos não puderem ser determinados.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Análise TIDE (Figura 4)
<ol>
	<li>Extração de DNA genômico (gDNA)18
	<ol>
		<li>Coletar moscas (ou larvas) submetidas ao choque térmico que carreguem ambos os DR-branco e I-SceI transgénio, como na prole do Cruzamento 1 (Figura 3A).</li>
		<li>Coloque moscas individuais em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e congele rapidamente (por exemplo, em banho de gelo seco/etanol ou nitrogênio líquido). 
		ATENÇÃO: Manipule gelo seco, nitrogênio líquido, etanol, isopropanol e outros produtos químicos utilizando equipamentos de proteção individual apropriados e seguindo os procedimentos de segurança institucionais. 
		PONTO DE PAUSA:&#160; As amostras podem ser armazenadas a -80 °C e processadas posteriormente, se necessário. Se estiver analisando moscas ou larvas, utilize uma única mosca ou larva por amostra. Se estiver analisando tecidos menores (por exemplo, cérebros, discos imaginais), reúna várias amostras para aumentar o rendimento de DNA.</li>
		<li>Homogeneíze cada amostra em 50 µL do Tampão A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM ácido etilenodiaminotetraacético [EDTA]; 100 mM cloreto de sódio; 0,5% dodecilsulfato de sódio [SDS]) utilizando um homogeneizador elétrico.</li>
		<li>Incubar as amostras em banho-maria a 65 °C por 30 min.</li>
		<li>Adicione 100 µL do Tampão B (1,4 M acetato de potássio, 4,3 M cloreto de lítio) a cada amostra e misture brevemente invertendo os tubos. 
		OBSERVAÇÃO: Se estiverem sendo utilizadas moscas inteiras, podem ser necessários volumes maiores para homogeneizar completamente as amostras. Nesse caso, mantenha uma proporção volumétrica de 1:2 Tampão A:Tampão B.</li>
		<li>Incube as amostras no gelo por pelo menos 30 min.</li>
		<li>Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfira 125 µL do sobrenadante clarificado para novos tubos microcentrífugos de 1,5 mL. Evite qualquer precipitado.</li>
		<li>Adicione 100 µL de isopropanol a 100% e temperatura ambiente por 125 µL de sobrenadante e misture brevemente invertendo os tubos.</li>
		<li>Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante, tendo cuidado para não perturbar o pellet de DNA. 
		OBSERVAÇÃO: O pellet de DNA pode não ser visível nesta etapa. Anote a orientação dos tubos ao colocá-los na microcentrífuga e aspire na face oposta àquela onde o pellet seria esperado.</li>
		<li>Lave os pellets com 250 µL de etanol a 70% gelado, misturando brevemente mediante inversão suave dos tubos.</li>
		<li>Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante, tendo cuidado para não perturbar o pellet. 
		OBSERVAÇÃO: O pellet pode ficar mais visível após a lavagem com etanol. Caso contrário, consulte Observação para a Etapa 2.1.11.</li>
		<li>Deixe os tubos destampados à temperatura ambiente para evaporar qualquer etanol remanescente. Evite a secagem excessiva do pellet, pois ele pode não se reconstituir completamente.</li>
		<li>Adicione 20 µL de água livre de nucleases e deixe os pellets reconstituírem durante a noite a 4 °C. 
		PONTO DE PAUSA: Se o pellet de DNA não tiver se dissolvido completamente, pode-se adicionar água adicional.</li>
		<li>No dia seguinte, inverta suavemente os tubos e meça a concentração de DNA. Armazene as amostras a -20 °C se não forem processadas imediatamente. 
		OBSERVAÇÃO: Para a extração de uma única mosca, os rendimentos são tipicamente de aproximadamente 100 ng/µL. Amostras de alta qualidade são importantes. A260/A280 a absorbância deve estar entre 1,7 e 2,0. Valores fora dessa faixa sugerem contaminantes, como proteínas. A260/A230 deve estar entre 2,0 e 2,2. Valores fora dessa faixa indicam contaminantes, como etanol e sais do tampão. Amostras com rendimento mais baixo e baixa qualidade podem resultar em amplificação PCR insatisfatória.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reação em cadeia da polimerase (PCR)
	<ol>
		<li>Amplificar em todo o trecho Sce.white por PCR usando 100 ng de DNAg e os iniciadores DR-branco_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) e DR-branco_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) seguindo as instruções do fabricante. Inclua um DR-branco controle de amostra de drosófila (ou seja, DR-branco estoque parental, sem I-SceI transgene presente). Utilize as seguintes condições de ciclagem: 94 °C por 3 min; {94 °C por 30 s; touchdown a 66 °C (-0,5 °C/ciclo) por 30 s; 72 °C por 30 s} x 16 ciclos; {94 °C por 30 s; 58 °C por 30 s; 72 °C por 30 s} x 20 ciclos; 72 °C por 5 min; mantido a 12 °C. 
		OBSERVAÇÃO: Se utilizar um reagente diferente, as condições de ciclagem podem precisar ser ajustadas.</li>
		<li>Rode aproximadamente 2 µL do produto de PCR em um gel diagnóstico de agarose a 1% em tampão tris-acetato-EDTA (TAE) para confirmar a amplificação de Sce.brancoO tamanho esperado do amplicon é aproximadamente 1,7 kb.</li>
		<li>purificação por PCR Sce.white amplicons e medir a concentração de DNA.</li>
		<li>Sequenciar o produto PCR purificado usando a iniciadora DR-branco_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC). 
		OBSERVAÇÃO: Normalmente sequenciamos 40 ng de produto de PCR purificado, mas isso pode variar conforme as instruções do serviço de sequenciamento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise TIDE 
	OBSERVAÇÃO: A maioria dos erros resultantes do uso do script R do TIDE pode ser atribuída à formatação incorreta do código.
	<ol>
		<li>Baixe os pacotes R necessários (ou seja, sangerseqR e Biostrings) do Bioconductor.org. Utilize a barra de pesquisa para localizar a versão mais recente de cada pacote.</li>
		<li>Analise os cromatogramas de sequência para garantir que sejam de boa qualidade. Analise apenas cromatogramas com pouco ou nenhum fundo precedendo o sítio de quebra.</li>
		<li>Baixe os arquivos de sequência de eletroferograma (com extensão .ab1) e coloque todos os arquivos em uma única pasta no computador. Simplifique ao máximo os nomes dos arquivos de sequência (por exemplo, F1, Het2, Hom3) para facilitar as edições de script nos passos seguintes.</li>
		<li>Abra o script R do TIDEArquivo Suplementar 1) no ambiente de desenvolvimento integrado do RStudio (IDE; consulte o Tabela de Materiais). No painel Fonte, localize a linha que começa com Control &#60;- (Arquivo Suplementar 2A) e digite o nome do arquivo de sequência controle exatamente como foi salvo, incluindo a extensão .ab1, entre aspas. 
		OBSERVAÇÃO: A "sequência controle" é a sequência da PCR do DR parentalbranco estoque sem I-SceI transgene ou indução</li>
		<li>Localize a linha que começa com samplename &#60;- c( e insira o nome de arquivo de cada sequência de amostra dentro dos parênteses (Arquivo Suplementar 2A). Inclua a extensão .ab1, coloque cada nome de arquivo entre aspas separadas e separe os nomes de arquivos com vírgulas.</li>
		<li>Salve o arquivo editado do script TIDE R na mesma pasta das sequências a serem analisadas. Mantenha o nome do arquivo simples para evitar erros nas etapas seguintes.</li>
		<li>No IDE, navegue até a pasta TIDE usando a guia Arquivos no painel de Saída (Arquivo Suplementar 2B).</li>
		<li>Clique no Mais menu suspenso e selecione Abrir Novo Terminal Aqui (Arquivo Suplementar 2C). Um novo terminal será aberto no painel do Console (inferior esquerdo).</li>
		<li>No terminal recém-aberto, digite “R” e pressione Entrar (Arquivo Suplementar 2D).</li>
		<li>Uma vez que o R esteja em execução no terminal, execute o script TIDE R digitando source(&#34;TIDE_analysis.R&#34;) e pressione Entrar (Arquivo Suplementar 2E). O terminal executará o script e produzirá uma representação gráfica (Arquivo Suplementar 2F) e um arquivo .csv contendo os dados brutos de cada amostra (Arquivo Suplementar 2G e Arquivo Suplementar 3). Os arquivos de saída são salvos na mesma pasta do script R e dos arquivos de sequência. 
		OBSERVAÇÃO: Se o mesmo script R for executado novamente, quaisquer novos arquivos .csv gerados sobrescreverão os anteriores. Se forem realizadas múltiplas análises nos mesmos arquivos, faça uma cópia da pasta.</li>
		<li>Analise os dados abrindo cada arquivo .csv.
		<ol>
			<li>Interprete os dados brutos como proporções de inserções e deleções (indels) na sequência da amostra. A conversão gênica por recombinação homóloga da sequência de reconhecimento I-SceI para a sequência selvagem SacI produz a deleção canônica de 23 pb; o script relata esse valor de RH em uma linha separada na parte inferior da saídaArquivo Suplementar 2G). O valor de 0-indel representa ausência de quebra dupla da fita (DSB) ou reparo por NHEJ sem indels. Some todos os demais valores de indel para obter o NHEJ com processamento. A soma do NHEJ com processamento e do reparo por HR corresponde ao número total de eventos de reparo de DSB detectáveis.</li>
			<li>Calcule as proporções das vias de reparo entre os eventos de reparo de quebras de dupla fita (DSB) detectáveis utilizando as seguintes equações: 
			Proporção de NHEJ com processamento = (NHEJ com processamento) / (NHEJ com processamento + RH) 
			Proporção de RH = (RH) / (NHEJ com processamento + RH) 
			OBSERVAÇÃO: Aproximadamente 10–15 amostras são utilizadas para cada condição em cada experimento genético (por exemplo, mutantes homozigóticos e controles heterozigóticos). Cada experimento genético é repetido 2–3 vezes, e os dados individuais são agrupados.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

Os autores não têm conflitos financeiros ou não financeiros a divulgar.

A versatilidade do sistema DR-white é um fator crucial que contribui para o seu impacto passado e futuro no campo da reparação do DNA. Primeiro, a sequência de integração attB dentro do construto repórter DR-white permite aos pesquisadores direcionar o repórter a diversas localizações no genoma de Drosophila21, com várias linhagens direcionadas já disponíveis22. Segundo, a disponibilidade de diferentes transgenes I-SceI, como expressão induzida por choque térmico por meio do promotor hsp70 (este estudo), expressão constitutiva por meio do promotor ubiquitin23 e expressão na linhagem germinativa pré-meiótica por meio do promotor Bam24, fornece diversos contextos desenvolvimentais e tecido-específicos para explorar a reparação de quebras de dupla fita (DSB). Independentemente do&#160;transgene I-SceI utilizado, os cruzamentos genéticos devem ser cuidadosamente planejados para garantir que o transgene I-SceI seja introduzido apenas no cruzamento final, assegurando a indução adequada das DSBs. É importante observar que as frequências de reparação podem variar significativamente dependendo da localização genômica do DR-white e/ou do transgene I-SceI&#160;utilizado. Experimentos futuros poderiam comparar ainda mais localizações genômicas e transgenes I-SceI para determinar se o contexto genômico ou a especificidade tecidual orienta a reparação de DSB.
Uma vantagem particular do ensaio DR-white e de seus derivados é que eles podem identificar a reparação de quebras de dupla fita (DSBs) por meio de recombinação homóloga, NHEJ com processamento e, na maioria dos casos, SSA. Embora projetado para detectar eventos de reparação na linhagem germinativa por meio de fenótipos, o sistema também permite a análise de tecidos somáticos por meio da análise algorítmica TIDE. Apesar desses benefícios, existem algumas limitações desse ensaio que devem ser consideradas. Notavelmente, o ensaio DR-white pode subestimar as frequências de RH. Como em outros ensaios com repórteres genéticos que utilizam DSBs induzidos por nucleases, a reparação por RH a partir de uma cromátide-irmã (RH entre cromátides-irmãs) é indistinguível de um evento sem DSB ou de NHEJ sem processamento. Assim, ao menos parte da classe Sem DSB/NHEJ pode corresponder a eventos de RH. Considerando essa limitação, os resultados que comparam fatores genéticos (como linhagens mutantes) devem ser interpretados com cautela. Outras limitações do ensaio incluem a incapacidade de quantificar eventos pré-meióticos que não geraram descendentes viáveis. Por exemplo, eventos de DSB que podem não ter sido reparados e que resultaram em morte celular não serão detectados na prole. Embora a fertilidade geral possa ser uma medida qualitativa da morte de células da linhagem germinativa, ensaios baseados em células (como TUNEL) podem ser necessários. Além disso, a análise por script R do TIDE fornece apenas a proporção de eventos detectáveis em uma população celular. Para determinar os resultados específicos de sequências de inserções e deleções (indels), é necessário o sequenciamento de eventos individuais de reparação por meio de sequenciamento de DNA multiplex.
O ensaio DR-white já teve um impacto profundo no estudo da reparação de quebras duplas na fita de DNA (DSB). Sua aplicação identificou fatores que contribuem para a reparação de DSB em organismos multicelulares, incluindo idade25, sexo26, localização da DSB22,26, localização da sequência doadora15, ciclo celular e tipo de tecido26. Além disso, empregamos o ensaio para identificar várias proteínas que também influenciam a escolha da via de reparação e/ou a reparação de sequências divergentes em Drosophila, incluindo Msh627, Blm28, Rif116 e CtIP16,29. De fato, o uso bem estabelecido de Drosophila como organismo modelo genético com proteínas conservadas de reparação do DNA fornece um sistema simples e multicelular para investigar os fatores genéticos, celulares e do organismo que contribuem para a reparação de DSB em contextos biológicos complexos.

A integridade genômica é frequentemente comprometida por lesões no DNA, dentre as quais as quebras de dupla fita (DSBs) são particularmente tóxicas. Se não forem reparadas, essas quebras podem levar à perda genética, rearranjos cromossômicos e morte celular.1. Assim, as células desenvolveram múltiplos mecanismos para reparar quebras de dupla fita (DSBs). A junção não homóloga de extremidades (NHEJ) liga diretamente as duas extremidades da DSB, podendo introduzir inserções ou deleções (indels) no local da quebra; fita simples&#160;a recombinação por sequências complementares (SSA) explora sequências complementares adjacentes ao local da quebra para reparo, resultando em deleções no local da quebra; enquanto a recombinação homóloga (HR) utiliza uma sequência homóloga como molde para o reparo2,3.
Historicamente, os estudos sobre reparo de quebras de dupla fita (DSB) foram limitados a ensaios bioquímicos4 ou sistemas unicelulares, como bactérias5,6, leveduras7,8 e culturas de células de mamíferos9,10. Embora esses modelos tenham sido fundamentais para identificar as proteínas centrais do reparo e seus mecanismos, eles carecem da complexidade biológica de um organismo multicelular. Drosophila melanogaster tornou-se um sistema modelo multicelular amplamente utilizado para o estudo da reparação do DNA. No entanto, muitos ensaios atuais são adaptados para vias de reparo específicas11; utilizam grandes aberrações cromossômicas, como a excisão de elementos P12; ou exigem análises moleculares demoradas13. O ensaio DR-white supera esses desafios ao fornecer um repórter genético simples para a reparação do DNA em Drosophila14. Este estudo apresenta um fluxo de trabalho completo, prático e detalhado, passo a passo, para realizar ensaios genéticos e moleculares destinados a medir o reparo de DSBs no DNA utilizando o bem estabelecido ensaio DR-white.
O ensaio utiliza duas repetições diretas do gene Drosophila white (w), que confere a cor vermelha selvagem dos olhos (Figura 1). Ambas as cópias são não funcionais: a primeira, Sce.white, contém uma inserção que carrega a sequência de reconhecimento da meganuclease I-SceI em um sítio SacI selvagem e introduz um códon de parada prematuro; a segunda, iwhite, está truncada nas extremidades 5’ e 3’ e serve como molde para reparo por recombinação homóloga (HR). Um transgene Drosophila yellow (y+), que confere a cor marrom selvagem do corpo, está presente entre as duas repetições de white. Como o cassete DR-white está integrado em um background mutante y w, as moscas DR-white são fenotipicamente selvagens quanto à coloração marrom do corpo e mutantes quanto à cor branca dos olhos.
As quebras de dupla fita (DSBs) podem ser induzidas em Sce.white cruzando moscas DR-white com moscas que carregam um transgene I-SceI. A reparação de DSBs na linhagem germinativa pré-meiótica pode ser medida por meio da análise da prole de um cruzamento-teste. A reparação por NHEJ resulta no fenótipo parental de corpo marrom e olhos brancos (Figura 1A), enquanto a reparação por HR restaura a sequência selvagem de white e produz descendentes com corpo marrom e olhos vermelhos (Figura 1B). A reparação por SSA da DSB ou uma troca mitótica resulta na perda do transgene yellow intercalado, gerando moscas com corpo amarelo e olhos brancos (Figura 1C). Para analisar os resultados da reparação em células somáticas, adaptamos o algoritmo Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) para detectar especificamente reparação por NHEJ com processamento e reparação por HR no ensaio DR-white15,16.
O ensaio DR-white oferece diversas vantagens em comparação com ensaios de reparo de DNA previamente estabelecidos em Drosophila. Como as quebras são geradas e reparadas na linhagem germinativa, os resultados do reparo podem ser detectados facilmente por meio de análise fenotípica. Ao mesmo tempo, o ensaio é extremamente versátil. Embora tenha sido projetado principalmente para medir o reparo por RH, ele pode detectar as três vias de reparo. Também desenvolvemos dois modelos de reparo funcionais adicionais (Figura 2). O modelo iwhite.mu contém 28 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) silenciosos e também produz descendentes com olhos vermelhos (Figura 2A), facilitando estudos sobre os comprimentos dos segmentos de conversão gênica (GCT) e o reparo por RH entre sequências divergentes14.&#160;O modelo iwhiteΔ9 contém uma deleção de nove pares de bases no sítio SacI do tipo selvagem e resulta em descendentes com olhos laranja (Figura 2B). Esse recurso permite aos pesquisadores acompanhar o reparo por RH a partir de modelos distintos, uma característica exclusiva do ensaio DR-white15.

<table><tbody><tr><td>Moedores de RNAse/DNAse-free de 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>Para homogeneização de amostras para extração de gDNA</td></tr><tr><td>Bolas de algodão</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>para cultivo padrão de Drosophila</td></tr><tr><td>Incubadora refrigerada por Peltier para Drosophila</td><td>Shel Lab</td><td>SRI6PF</td><td>para cultivo padrão de Drosophila</td></tr><tr><td>Estirpe de Drosophila: y[1] w[1]</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>Estirpe de Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>criada pelo laboratório LaRocque por meio de recombinação padrão da estirpe RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) do Bloomington Drosophila Stock Center; disponível mediante solicitação ao autor correspondente</td></tr><tr><td>Estirpe de Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>ensaio DR-white integrado na estirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponível mediante solicitação ao autor correspondente</td></tr><tr><td>Estirpe de Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>ensaio DR-white.mu integrado na estirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponível mediante solicitação ao autor correspondente</td></tr><tr><td>Estirpe de Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>doador iwhite&amp;Delta;9 integrado na estirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponível mediante solicitação ao autor correspondente</td></tr><tr><td>Tampas para frascos de Drosophila Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>para cultivo padrão de Drosophila</td></tr><tr><td>Stereo microscópio fluorescente (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>para manipulação e classificação padrão de &quot;moscas&quot; com base na fluorescência</td></tr><tr><td>Almofada FlyStuff para Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>para manipulação padrão de &quot;moscas&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria MyBath 4L</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>para&amp;nbsp; choque térmico</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>para quantificação de DNA</td></tr><tr><td>Mídia Nutri-fly Bloomington Formulation</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>para cultivo padrão de Drosophila</td></tr><tr><td>Homogeneizador motorizado sem fio Pellet Pestle</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>Para homogeneização de amostras para extração de gDNA</td></tr><tr><td>Frasco de polipropileno</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>para cultivo padrão de Drosophila</td></tr><tr><td>Frascos de poliestireno</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>para cultivo padrão de Drosophila, incluindo choque térmico</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotídeo DR-white_8f</td><td>N/A; qualquer serviço de síntese de oligonucleotídeos é suficiente</td><td>N/A</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotídeo DR-white_8a</td><td>N/A; qualquer serviço de síntese de oligonucleotídeos é suficiente</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotídeo DR-white_9f</td><td>N/A; qualquer serviço de síntese de oligonucleotídeos é suficiente</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Posit</td><td>Version 2023.06.1+524</td><td>Versão gratuita para download; qualquer versão do R Studio é aceitável, embora os dados apresentados tenham sido analisados usando&amp;nbsp; a versão 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>Pacotes do R Studio: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (Version 3.24)</td><td>Version 2.76.0</td><td>O script R solicitará ao usuário a instalação deste pacote</td></tr><tr><td>Pacotes do R Studio: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (Version 3.24)</td><td>Version 1.44.0</td><td>O script R solicitará ao usuário a instalação deste pacote</td></tr><tr><td>SapphireAMP Fast PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscópio</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>para manipulação padrão de &quot;moscas&quot;</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean up&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo a reparo de quebras dupla-fita do dna utilizando o ensaio dr-white em drosophila melanogaster

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

Estudos tradicionais sobre reparo de quebras duplas na fita de DNA (DSB) frequentemente se limitam a investigações bioquímicas ou sistemas unicelulares (por exemplo, células, leveduras). Para facilitar estudos sobre reparo de DSB em um organismo multicelular, utilizamos o ensaio DR-white em Drosophila melanogaster. O ensaio DR-white é um ensaio repórter simples, porém versátil, para reparo de DSB, que contém uma única sequência de reconhecimento I-SceI, a qual pode ser clivada pela expressão da meganuclease I-SceI. A expressão de I-SceI pode ser induzida constitutivamente, por choque térmico ou por meio de outros promotores, permitindo investigações sobre reparo específicos de tecido ou de desenvolvimento. Uma vantagem principal do ensaio é a capacidade de distinguir os resultados do reparo envolvendo recombinação homóloga (HR), junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e emparelhamento de fita simples (SSA). Este artigo fornece um protocolo detalhado para o ensaio DR-white já estabelecido, incluindo um fluxo de trabalho passo a passo para induzir DSBs na linhagem germinativa pré-meiótica e analisar fenotipicamente os eventos de reparo por meio da contagem da prole. Também descreve a análise molecular dos eventos de reparo por reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento e o script R Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Este protocolo fornece uma ferramenta útil para investigar os mecanismos genéticos e moleculares do reparo do DNA em um modelo de organismo.

Drosophila necessidade de Rad51 para reparo por recombinação homóloga
Experimentos bem-sucedidos na linhagem germinativa produzem as classes fenotípicas esperadas mostradas na Figura 3A e pelo menos 20 descendentes analisáveis por frasco. Fenótipos inesperados ou menos de 20 descendentes analisáveis indicam contaminação ou produtividade insuficiente e devem ser excluídos conforme especificado na etapa 1.4.3. Para a análise TIDE, amostras bem-sucedidas produzem um amplicon de aproximadamente 1,7 kb e cromatogramas com pouca interferência antes do local da quebra; DNA de baixo rendimento ou contaminado e cromatogramas com ruído são subótimos e não devem ser analisados.
Ao utilizar o ensaio DR-white com uma fonte de I-SceI induzível por choque térmico, a frequência de reparo por RH em moscas selvagens é de 38,5 ± 1,2% (média ± erro padrão da média), enquanto o reparo por ASS ocorre em cerca de 3,2 ± 0,35% (Figura 3B&#160;e Arquivo Suplementar 4). A proteína Rad51 (codificada pelo gene homólogo spnA em Drosophila) é necessária para a etapa de invasão da fita no processo de recombinação homóloga14,19. Assim, a perda de Rad51 deve resultar em um reparo ineficiente por RH. De fato, em um background DmRad51-/-, o reparo por RH é reduzido para 1,3 ± 0,4%, com um aumento concomitante no reparo por ASS (34,5 ± 1,8%; Figura 3B&#160;e Arquivo Suplementar 4)14. Isso provavelmente ocorre porque eventos de reparo que normalmente seguiriam a via de recombinação homóloga são direcionados alternativamente para o reparo por emparelhamento de fitas simples das sequências repetidas de white.
Drosophila CtIP contribui para uma reparação eficiente por RH em tecidos somáticos
O algoritmo TIDE permite a medição da escolha da via de reparo em células somáticas. Em um contexto não mutante, a NHEJ com processamento ocorre em 59,0% dos eventos de reparo detectáveis, e a RH ocorre em 41,0% (Figura 4B&#160;e Arquivo Suplementar 4). A CtIP desempenha um papel importante na iniciação do reparo por RH ao promover a ressecção das extremidades do DNA20. Assim, em um contexto DmCtIP-/-, a escolha da via de RH é marcadamente reduzida em células somáticas, passando de 41,0% em controles heterozigotos para 10,9% em mutantes homozigotos (Figura 4B e Arquivo Suplementar 4)16. Isso sugere que, em Drosophila, a CtIP contribui para o reparo por RH, mas não é essencial para esse processo.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
Figura 1: Ensaio do repórter DR-white para quebras de dupla fita e os resultados de reparo. O ensaio da repetição direta de white contém duas cópias não funcionais do gene white: Sce.white (com uma inserção de 23 pb contendo o sítio de reconhecimento I-SceI e introduzindo um códon de parada prematuro) e iwhite (sequência doadora truncada nas extremidades 5′ e 3′). Cruzar moscas contendo DR-white e um transgene I-SceI produz uma quebra de dupla fita específica que pode ser analisada fenotipicamente ou molecularmente. Os fenótipos resultantes são: (A) descendentes com olhos brancos (y+ w−), indicando ausência de quebra de dupla fita, recombinação homóloga entre cromátides-irmãs ou reparo por NHEJ; (B) descendentes com olhos vermelhos (y+ w+), indicando recombinação homóloga intracromossômica que restaura a sequência selvagem SacI a partir da doadora iwhite; e (C) descendentes com corpo amarelo e olhos brancos (y− w−), indicando reparo por emparelhamento de fita simples (SSA) ou crossing-over mitótico. Figura adaptada de Do et al.14. Abreviaturas: CO = crossing-over; DR-white = Repetição direta de white; DSB = quebra de dupla fita; HR = recombinação homóloga; NHEJ = junção de extremidades não homólogas; SSA = emparelhamento de fita simples. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
Figura 2: Derivados do ensaio DR-white. (A) O ensaio DR-white.mu contém 28 SNPs silenciosos na sequência doadora iwhite.mu, gerando 1,4% de divergência de sequência entre as repetições diretas. A conversão gênica de polimorfismos individuais varia entre os eventos de RH e pode ser determinada por sequenciamento. (B) O sistema DR-white com o doador iwhiteΔ9 distingue a recombinação inter-homóloga da intracromossômica. A RH a partir do doador intracromossômico iwhite restaura a sequência selvagem SacI e produz descendentes com olhos vermelhos. A RH a partir do doador inter-homólogo iwhiteΔ9 produz descendentes com olhos laranja, pois a deleção de 9 pb reduz a expressão de white. A figura adaptada de Do et al.14 e Fernandez et al.15. Abreviações: DSB = quebra de dupla fita; HR = recombinação homóloga; SNP = polimorfismo de nucleotídeo único. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
Figura 3: Fluxo experimental para detecção dos resultados da reparação de quebras de dupla fita na linhagem germinativa pré-meiótica. (A) O Cruzamento 1 combina o repórter DR-white (ou um derivado) com um transgene I-SceI (neste exemplo, no cromossomo dois). A prole contendo tanto o ensaio DR-white quanto o transgene I-SceI mantém os eventos de reparação em seus tecidos germinativos e somáticos. Para analisar eventos individuais de reparação na linhagem germinativa pré-meiótica, a prole que carrega ambos os transgenes é cruzada com moscas-teste y w (Cruzamento 2), e a prole é pontuada conforme descrito na Figura 1. (B) Eventos individuais de reparação de quebras de dupla fita na linhagem germinativa de moscas selvagens (n = 106 linhagens germinativas) e mutantes homozigotos DmRad51 (n = 46 linhagens germinativas). **P &#60; 0,01; ****P &#60; 0,0001 pela ANOVA de dois fatores seguida pelo teste de comparações múltiplas de Sidak. As barras representam as médias; as barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Os dados foram reanalisados de Do et al.14. Abreviações: ANOVA = análise de variância; CO = crossing-over; DSB = quebra de dupla fita; HR = recombinação homóloga; NHEJ = junção de extremidades não homólogas; SEM = erro padrão da média; SSA = emparelhamento de fita simples. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
Figura 4: Fluxo experimental para detecção dos resultados da reparação de quebras de dupla fita utilizando o Rastreamento de Inserções e Deleções por DEcomposição (TIDE). (A) Moscas portadoras do alelo DR-white e um transgene induzido I-SceI são analisadas por extração de DNA genômico, amplificação por PCR no local da quebra de dupla fita, sequenciamento Sanger e análise TIDE com o script em R. (B) Dados representativos de mutantes DmCtIP-/-&#160; (n = 23) e controles heterozigotos DmCtIP+/-&#160; (n = 31). Os eventos de reparação detectáveis são calculados como recombinação homóloga somada à junção de extremidades não homóloga com processamento, excluindo-se a ausência de quebra de dupla fita ou junção de extremidades não homóloga sem inserções ou deleções. ****P &#60; 0,0001 por ANOVA de dois fatores seguida pelo teste de comparações múltiplas de Sidak. As barras representam as médias; as barras de erro representam o erro padrão da média. Os dados foram reanalisados de Thomas et al.16. Abreviaturas: ANOVA = análise de variância; DSB = quebra de dupla fita; gDNA = DNA genômico; HR = recombinação homóloga; NHEJ = junção de extremidades não homóloga; PCR = reação em cadeia da polimerase; SEM = erro padrão da média; TIDE = Rastreamento de Inserções e Deleções por DEcomposição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Script R do TIDE para identificar inserções e deleções em cromatogramas de sequência em relação a um controle sem DSB. O nome do arquivo controle editável pelo usuário, os nomes dos arquivos de amostra e a sequência-alvo do I-SceI estão indicados próximo ao final do script. As entradas necessárias, arquivos de saída e sua interpretação são descritos na seção 2.3. São necessários os pacotes sangerseqR e Biostrings.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Guia com capturas de tela passo a passo do fluxo de trabalho do script R do TIDE. Os painéis ilustram as ações do software descritas na seção 2.3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 3: Exemplo de saída do TIDE e cálculos de eventos de reparo. O valor 0-indel representa ausência de quebra dupla da fita (DSB) ou NHEJ sem indels; a linha HR separada representa o produto canônico com deleção de 23 pb; e todos os percentuais restantes de indel são somados como NHEJ com processamento. O reparo detectável total é calculado como HR mais NHEJ com processamento.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 4: Dados brutos que sustentam as Figuras 3B e 4B, organizados em planilhas editáveis separadas. Esses dados foram reanalisados a partir dos estudos previamente publicados citados nas legendas correspondentes das figuras.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O ensaio DR-white é um ensaio genético versátil com repórter para detectar os resultados da reparação de quebras de dupla fita no DNA no organismo multicelular Drosophila melanogaster.

Medindo a Reparo de Quebras Dupla-Fita do DNA Utilizando o Ensaio DR-white em Drosophila melanogaster

Estudos tradicionais sobre o reparo de quebras de fita dupla (DSB) do DNA são frequentemente limitados a investigações bioquímicas ou sistemas unicelulares (ex.: células, ...

Nosso laboratório tem interesse na área de integridade do genoma, com foco em como as células reparam quebras duplas na fita de DNA. Diferentemente de outros ensaios de reparo de DNA, o ensaio DR-white em Drosophila mede o reparo de quebras duplas na fita em contextos multicelulares, incluindo células somáticas e germinativas.Após realizar os cruzamentos genéticos e a indução da quebra de dupla fita, permita que a prole do cruzamento-teste se desenvolva em condições próximas. A partir do momento em que as primeiras moscas emergirem, classifique a prole ao longo de aproximadamente nove dias. Anestesie as moscas utilizando dióxido de carbono ou transfira-as para um tubo vazio sem alimento e congele-as a -20 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Coloque as moscas sobre uma placa para moscas. Para a classificação, identifique as moscas que carregam a repetição direta do gene white ou o cassete DR-white utilizando a fluorescência de RFP. Avalie as cores dos olhos e do corpo. O transgene y-plus ligado ao cassete DR-white produz uma cor marrom intermediária do corpo que não é totalmente selvagem. Compare essas moscas com a prole yellow white negativa para RFP, que não possui o cromossomo DR-white, para distinguir a ausência de quebra de dupla fita ou a junção de extremidades não homólogas da união por emparelhamento de fita simples. Classifique como ausência de quebra de dupla fita ou junção de extremidades não homólogas as moscas com cor do corpo mais escura e acastanhada. Inclua apenas os tubos com pelo menos 20 moscas classificadas no conjunto de dados.Para a análise molecular dos eventos de reparo, colete as moscas submetidas ao choque térmico que carregam ambos os transgenes DR-white e I-SceI, conforme na prole do Cruzamento 1. Coloque moscas individuais em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro e congele rapidamente as amostras em banho de gelo seco e etanol. Homogeneíze cada amostra em 50 microlitros do tampão A utilizando um homogeneizador elétrico. Em seguida, incube as amostras em banho-maria a 65 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 100 microlitros do tampão B a cada amostra e misture brevemente invertendo os tubos. Incube as amostras em gelo por pelo menos 30 minutos, depois centrifugue-as a aproximadamente 16.000 g por 15 minutos a 4 graus Celsius. Transfira 125 microlitros do sobrenadante clarificado para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, evitando qualquer precipitado. Adicione 100 microlitros de isopropanol e misture brevemente invertendo o tubo. Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet de DNA. Lave o pellet com 250 microlitros de etanol 70% gelado, e misture suavemente invertendo o tubo. Centrifugue as amostras a aproximadamente 16.000 g por cinco minutos a 4 graus Celsius e aspire novamente o sobrenadante. Deixe o tubo descoberto à temperatura ambiente para evaporar o etanol residual sem sobressecar o pellet. Em seguida, adicione 20 microlitros de água livre de nucleases e deixe o pellet se reconstituir durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, bata suavemente no tubo para misturar e meça a concentração de DNA.Amplifique a região Sce.white por PCR usando 100 nanogramas de DNA genômico e os primers DR-white sentido e antissentido. Inclua o DNA genômico de uma mosca controle DR-white que carece do transgene I-SceI, em seguida realize a reação usando condições térmicas adequadas. Carregue aproximadamente 2 microlitros do produto de PCR em um gel de Tris-acetato-EDTA a 1% para confirmar a amplificação de Sce.white. Confirme que o amplicon tenha aproximadamente 1,7 quilobases, então purifique os amplicons de Sce.white. Meça a concentração de DNA e sequencie o produto de PCR purificado utilizando o primer de sequenciamento DR-white.Após baixar os pacotes R necessários, examine os cromatogramas de sequência e selecione apenas aqueles com pouco ou nenhum ruído de fundo anterior ao local da quebra para análise. Baixe os arquivos de traçado de sequência com a extensão .ab1. Coloque todos em uma única pasta do computador e simplifique os nomes dos arquivos de sequência o máximo possível. Abra o script R Tracking of Indels by DEcomposition ou TIED no ambiente de desenvolvimento integrado RStudio. No painel de origem, localize a linha que começa com control e insira exatamente o nome do arquivo de sequência controle, conforme salvo, incluindo a extensão entre aspas. Localize a linha que começa com sample name e insira o nome de cada arquivo de sequência da amostra dentro dos parênteses, colocando cada nome de arquivo entre aspas separadas e separando-os com vírgulas. Em seguida, salve o script R TIED editado na mesma pasta das sequências a serem analisadas. No ambiente de desenvolvimento integrado, navegue até a pasta TIED usando a aba Arquivos no painel de saída. Clique na seta More e selecione Abrir Novo Terminal Aqui. No terminal recém-aberto, digite R e pressione Enter. Assim que o R estiver em execução, execute o script R TIED digitando o comando source com o nome do arquivo do script e pressione Enter. O script produz uma representação gráfica e um arquivo de valores separados por vírgulas contendo os dados brutos de cada amostra. Abra cada arquivo de valores separados por vírgulas e interprete os dados brutos como as proporções de indels na sequência da amostra. Por fim, identifique a deleção canônica de 23 pares de bases relatada separadamente na parte inferior da saída como o valor de recombinação homóloga. Interprete o valor de indel 0 como ausência de quebra de dupla fita ou junção de extremidades não homóloga sem indels, e some os demais valores de indel para determinar a junção de extremidades não homóloga com processamento.Experimentos bem-sucedidos na linhagem germinativa produziram as classes fenotípicas esperadas e pelo menos 20 descendentes analisáveis por frasco. Em moscas selvagens que expressam I-SceI induzível por choque térmico, a recombinação homóloga ocorreu em aproximadamente 38,5% dos descendentes, comparado com 3,2% para o emparelhamento de cadeia simples. Em um background mutante homozigoto para DmRad51, a reparação por recombinação homóloga foi reduzida a aproximadamente 1,3%, com aumento concomitante da reparação por emparelhamento de cadeia simples para cerca de 34,5%. Em células somáticas de um background não mutante, a junção de extremidades não homóloga com processamento representou cerca de 59% dos eventos de reparação detectáveis, e a recombinação homóloga, 41%. Em um background mutante homozigoto para DmCtIP, a escolha pela via de recombinação homóloga foi reduzida a 10,9%.Este protocolo pode ser aplicado a diversos tecidos, estágios de desenvolvimento e localizações genômicas para determinar fatores que impactam o reparo. Além disso, este ensaio foi modificado para medir resultados do reparo, como os comprimentos das trilhas de conversão gênica e a preferência pelo molde de reparo. Este ensaio de reparo do DNA pode ser utilizado para determinar diversos fatores envolvidos no reparo, utilizando mutantes genéticos em Drosophila.

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de imunofluorescência para detectar proteínas específicas de resposta a danos no DNA localizadas nos locais de quebras de fita dupla de DNA em células mononucleares humanas. As proteínas são reconhecidas por anticorpos primários específicos, que por sua vez se ligam a anticorpos secundários marcados com fluoróforo que fluorescem durante a visualização microscópica, permitindo a visualização das proteínas como focos fluorescentes distintos dentro...

Microscopia de imunofluorescência para análise de quebras de fita dupla de DNA

A epiderme embrionárias de fase muito tardia embriões de Drosophila fornece um sistema in vivo para análise da resposta punção ferida rápido e pode ser combinado com manipulações genéticas ou tratamentos químicos microinjeção para avançar os estudos na cicatrização de feridas para a tradução em modelos de mamíferos.

Microinjeção Ferida Ensaio e<em&gt; In vivo</em&gt; Localização de Epidermal Wound resposta Jornalistas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões.

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

Nós apresentamos um protocolo usando uma aproximação genética para a frente à tela para os mutantes que exibem a neurodegeneração no melanogaster de Drosophila. Incorpora um ensaio de escalada, uma análise da histologia, um mapeamento do gene e um sequenciamento do ADN para identificar finalmente genes novos relativos ao processo de neuroprotection.

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

Este protocolo é projetado avaliar a viabilidade de Drosophila em cada estágio desenvolvente, do embrião ao adulto. O método pode ser utilizado para determinar e comparar a viabilidade de diferentes genótipos ou condições de crescimento.

Um método direto e simples para avaliar a viabilidade da Drosophila melanogasterdo embrião ao adulto

A integridade da barreira hematoencefálica é fundamental para a função do sistema nervoso. Na Drosophila melanogaster, a barreira hematoencefálica é formada por células gliais durante a embriogênese tardia. Este protocolo descreve métodos para o ensaio para a formação e a manutenção da barreira do sangue-cérebro em embriões do melanogaster do D. e em larvas do terceiro instar.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

Este protocolo descreve um ensaio extracromossômico de junção final não homóloga (NHEJ) e um ensaio de recombinação homóloga (HR) para quantificar a eficiência de NHEJ e HR em células HEK-293T.

Análise da Eficiência de Junção de Extremidade Não Homóloga e Recombinação Homóloga em Células HEK-293T Usando Sistemas Reporter Baseados em GFP

Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

Aprenda o ensaio DR-white para medir reparo de quebras dupla-fita do DNA em Drosophila melanogaster. Este método distingue entre recombinação homóloga, NHEJ e anelamento de fita simples em organismos multicelulares.

Medindo a Reparo de Quebras Dupla-Fita do DNA Utilizando o Ensaio DR-white em Drosophila melanogaster

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