Separação eletroforética de proteínas

A separação de proteínas individuais a partir de misturas proteicas complexas pode ser realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida, também conhecida como PAGE. As proteínas migram em resposta a um campo elétrico através dos poros da matriz do gel. A combinação do tamanho dos poros do gel com a carga, o tamanho e a forma da proteína determina a taxa de migração da proteína. Neste vídeo, demonstraremos um método para separação eletroforética de proteínas.

Olá, eu sou o Dr. Bobul Chakravarti do Centro de Proteômica do Instituto Graduado Keck de Ciências da Vida Aplicadas. Hoje vou mostrar a vocês um procedimento para realizar eletroforese em gel 1D. Então, vamos começar.

Para começar, monte o sanduíche de placas de vidro do aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante, utilizando duas placas de vidro limpas e dois espaçadores de 1,5 milímetro. Agora, fixe o sanduíche de placas de vidro na plataforma de moldagem. Em seguida, prepare a solução do gel separador, que foi descrita nos protocolos atuais.

Adicione a quantidade especificada de 10% de persulfato de amônio e teed à solução e misture suavemente. Devido à alta concentração de acrilamida, a dessurgelagem não é necessária. Usando uma pipeta plástica descartável de 10 mililitros, aplique imediatamente a solução do gel de separação sobre o sanduíche ao longo de uma borda de um dos espaçadores até que a altura da solução entre as lâminas de vidro seja de aproximadamente 11 centímetros.

Em seguida, utilize outro pipeta para cobrir lentamente a parte superior do gel com uma camada de aproximadamente um centímetro de espessura de álcool isobutílico saturado com água ou água destilada. Faça isso aplicando suavemente a água ao longo da borda de um, e depois do outro espaçador, deixando o gel polimerizar por 30 a 60 minutos. À temperatura ambiente, a sobreposição de água garante que o gel de acrilamida polimerize em uma linha reta.

Uma vez que o gel polimeriza, estamos prontos para verter o gel de empilhamento. Primeiro, remova a camada de água destilada e depois enxágue com tris CL 1x em SDS a um pH de 8,8. Agora prepare a solução do gel de empilhamento conforme indicado nos protocolos atuais.

Em seguida, utilizando uma pipeta de plástico, deixe lentamente a solução do gel de empilhamento escorrer para o centro do sanduíche ao longo de uma borda de um dos espaçadores, até que a altura da solução no sanduíche esteja a cerca de um centímetro do topo das placas. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no gel de empilhamento. Após o gel ser vertido, insira um pente de teflon de 0,75 milímetro na camada de solução de gel de empilhamento.

Deixe a solução do gel de empilhamento polimerizar de 30 a 45 minutos à temperatura ambiente; agora estamos prontos para preparar as amostras de proteína. Para iniciar o preparo das amostras de proteína, dilua uma porção da amostra de proteína a ser analisada em uma proporção de um para um com tampão amostra SDS a 2X.

Para soluções proteicas diluídas, considere usar uma mistura de proteína em proporção de cinco para um com tampão amostral SDS seis vezes concentrado. Se a amostra for um pellet proteico precipitado, dissolva a proteína em 50 a 100 microlitros de tampão amostral SDS 1X. Aqueça agora as amostras por três a cinco minutos a 100 graus Celsius em um tubo de microcentrífuga com tampa rosqueável e vedada, dentro de um banho-maria.

Em seguida, remova cuidadosamente o pente de teflon sem rasgar as bordas dos poços de poliacrilamida. Após a remoção do pente, enxágue os poços com tampão de eletroforese SDS 1X. Em seguida, utilizando uma pipeta, preencha os poços com tampão de eletroforese SDS 1X.

Após a lavagem e o preenchimento dos poços com tampão, fixe o sanduíche de gel à câmara superior de tampão. Seguindo as instruções do fabricante, preencha a câmara inferior de tampão com a quantidade recomendada de tampão de eletroforese XSDS 1X. Em seguida, coloque o sanduíche, fixado à câmara superior de tampão, dentro da câmara inferior de tampão.

Agora, preencha completamente a câmara superior de tampão com tampão de eletroforese XSDS, de modo que os poços de amostra do gel de empilhamento fiquem cheios de tampão. O gel está agora pronto para ser carregado; utilizando uma pipeta automática de 25 ou 100 microlitros com ponteiras para carregamento de géis, adicione a amostra proteica em um ou mais poços, aplicando cuidadosamente a amostra como uma camada fina no fundo dos poços. Carregue os poços de controle com padrões de peso molecular.

Adicione também um volume igual de tampão amostral XSDS a todos os poços vazios para evitar a difusão das faixas adjacentes. Estamos agora prontos para iniciar a eletroforese em gel. Para executar o gel, conecte a fonte de alimentação à câmara e execute-a com uma corrente constante de 30 miliampères para um gel em placa com espessura de 1,5 milímetro.

Depois que a tinta azul de rastreamento com mentol atingir a base do gel de separação, desconecte a fonte de alimentação. Agora que a eletroforese terminou, descarte o tampão de eletroforese e remova a câmara superior de tampão com o sanduíche de gel acoplado. Oriente o gel de modo que a ordem dos poços de amostra seja conhecida.

Em seguida, remova o sanduíche da câmara superior de tampão e coloque-o sobre uma folha de papel absorvente ou toalha de papel. Depois, com cuidado, deslize um dos espaçadores pela metade a partir da borda do sanduíche ao longo de todo o seu comprimento. Use o espaçador exposto como alavanca para abrir cuidadosamente a placa de vidro, expondo o gel com cautela.

Remova o gel da placa inferior. Corte um pequeno triângulo em um dos cantos do gel para que a orientação das bandas não se perca durante a coloração e a secagem. O procedimento de eletroforese em gel está agora concluído.

O gel pode agora ser processado utilizando diversos procedimentos de detecção de proteínas. Acabamos de mostrar como separar proteínas usando eletroforese em gel. Assim sendo, é isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.