Name: Eletroporação de Micobactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação para transformação de micobactérias usando Mycobacterium smegmatis. Este método otimizado supera a barreira da parede celular espessa, permitindo introdução eficiente de DNA em pesquisas de microbiologia.

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Os autores não têm nada a declarar.

eletroporação de micobactérias

Electroporation of Mycobacteria

Transformação de alta eficiência é uma limitação importante no estudo das micobactérias. O gênero Mycobacterium pode ser difícil de transformar, este é causada principalmente pela parede celular de espessura e cera, mas é agravado pelo fato de que a maioria das técnicas moleculares têm sido desenvolvidos para espécies distantemente relacionadas, tais como Escherichia coli e Bacillus subtilis. Apesar desses obstáculos, plasmídeos micobactérias foram identificadas e transformação DNA de muitas espécies de micobactérias já foram descritos. O método de maior sucesso para a introdução de DNA em micobactérias é eletroporação. Parâmetros que contribuem para a transformação bem-sucedida, que incluem a espécie / variedade, a natureza do DNA de transformação, o marcador selecionável utilizado, o meio de crescimento, e as condições para o pulso eletroporação. Métodos otimizados para a transformação de ambos lenta e produtor-rápida são detalhados aqui. Eficiência de transformação para diferentes espécies de micobactérias e com vários marcadores selecionáveis ​​são relatados.

Estratégias de micobactérias patogênicas continuam a ser mal compreendido. A taxa de crescimento lento da maioria das espécies, a natureza impenetrável do da parede celular, e os perigos de trabalhar com agentes patogénicos fazer micobactérias difíceis de estudar e são em grande parte responsáveis ​​por nossa má compreensão destes organismos. Neste vídeo iremos demonstrar a técnica da eletroporação, que envolve as células sujeitando a um impulso de alta breve elétrico para permitir a entrada de DNA. É o método mais utilizado para a introdução de DNA em células micobacterianas.

Eletroporação de Micobactérias

A transformação de alta eficiência é uma limitação importante no estudo de micobactérias. O gênero Mycobacterium pode ser difícil de transformar; isso se deve principalmente...

As estratégias patogênicas de micobactérias ainda são pouco compreendidas devido à taxa de crescimento lento da maioria das espécies. A natureza impermeável da parede celular e os riscos associados ao trabalho com patógenos tornam as micobactérias difíceis de estudar e são em grande parte responsáveis pela nossa compreensão limitada desses organismos. Neste vídeo, demonstraremos a técnica de eletroporação, que envolve submeter as células a um impulso elétrico breve e de alta intensidade, permitindo a entrada de DNA.É o método mais amplamente utilizado para introduzir DNA em células micobacterianas. Olá, sou Ron Good do laboratório de Tanya Parish do Centro de Doenças Infecciosas em Bats e da Escola de Medicina e Odontologia de Londres. Hoje vamos mostrar um procedimento para eletroporação de micobactérias.No nosso laboratório, estudamos Microbacterium tuberculosis, mas como ele é altamente patogênico e requer instalações de contenção C3, mostraremos esta técnica no Microbacterium smegmatis não patogênico. Então, vamos eletroporar algumas bactérias. Para eletroporar micobactérias, precisamos produzir células competentes.É importante lembrar que micobactérias patogênicas representam um risco biológico significativo. Portanto, todos os cultivos e manipulações genéticas devem ser realizados em uma contenção apropriada. As instalações dentro de uma cabine de segurança classe um devem ter a avaliação de risco como primeira etapa de qualquer experimento com micobactérias patogênicas.Para preparar esses meios, iniciamos com o cultivo mantido em laboratório em meios sólidos, como lemko, inóculo auger, ou caldo Lemko contendo tween a cinco mils, com um alça cheia de micobactérias. Como muitas micobactérias são organismos de crescimento relativamente lento, é extremamente importante manter uma boa técnica asséptica para prevenir a contaminação desses cultivos com bactérias ou fungos que possam crescer rapidamente e superar as micobactérias. É frequentemente aconselhável preparar cultivos em duplicata, caso um deles venha a ser contaminado.As células de micobactérias têm tendência a se agrupar em cultura devido ao seu espesso revestimento ceroso. A agitação em vórtex e a adição de um detergente não iônico, como o Tween 82 ao meio, reduzem esse agrupamento e proporcionam uma suspensão celular mais homogênea. Após a inoculação, incubar a cultura a 37 graus Celsius com agitação a cem RPM durante a noite.Após o crescimento da cultura inicial, inocular uma cultura em larga escala com cerca de cem mililitros de caldo lemko em um frasco cônico de 250 mililitros com uma diluição de 1 para 100 da cultura de crescimento noturno. Continuar a incubação a 37 graus Celsius com agitação por cerca de 16 a 24 horas, momento em que a densidade óptica pode ser verificada com o espectrofotômetro. Se a leitura for de 0,8 a 1, as células estarão na fase logarítmica de crescimento ideal.Em seguida, incubar as células no gelo por 1,5 hora antes da colheita, o que ajudará a aumentar a eficiência de transformação em quatro vezes. Incubações mais longas no gelo resultam em eficiência reduzida. A seguir, colher as células despejando os cultivos em tubos grandes de centrífuga.Centrifugue a 300 Gs por 10 minutos; após a centrifugação, lave as células três vezes em glicerol a 10% gelado, reduzindo o volume a cada vez, de modo que, para um volume de cultura de cem mililitros, sejam utilizados 20 mililitros na primeira lavagem, depois 10 mililitros e, finalmente, cinco mililitros na última lavagem. Após as lavagens, ressuspenda as células em um volume entre um para 10 e um para 100 do volume original em glicerol a 10% gelado. Nesta etapa, as células podem ser aliquotadas, congeladas e armazenadas a menos 70 graus Celsius para uso futuro.A eficiência de transformação geralmente aumenta após o congelamento das células. Antes de usar essas células competentes, elas devem ser descongeladas, coletadas por centrifugação e ressuspendidas em glicerol a 10% fresco antes do uso. Para realizar a eletroporação, é necessário um eletroporador, que é um aparelho capaz de fornecer um pulso de alta voltagem de 2,5.Utiliza-se quilovolts. Bactérias e DNA são colocados em cubetas para eletroporação. E embora a distância ou comprimento do caminho possa ser a mesma em cubetas diferentes, elas variam quanto ao volume que podem conter.Usamos rotineiramente 200 microlitros de células em uma cubeta de 0,2 centímetros para eletroporar as células. Primeiro, prepare a amostra de DNA de forma que esteja livre de sais e outros contaminantes. Isso é importante para minimizar as chances de arco durante a eletroporação.Antes de colocar as bactérias, certifique-se de que suas amostras de DNA possuam alta pureza. A razão de absorvância entre 60 a 80 deve estar próxima de 1,8. Adicione de 0,5 a cinco microgramas de DNA livre de sal em um volume não superior a cinco microlitros a 200 microlitros de suspensão microbacteriana. Pode-se incluir uma eletroporação controle sem DNA para verificar a frequência de mutantes resistentes ao antibiótico.Em seguida, deixe a mistura em gelo por 10 minutos. Isso reduzirá a presença de células vivas na amostra e de sais na solução de DNA, o que minimizará a ocorrência de arco elétrico após a incubação em gelo. Re-suspenda completamente as células com uma pipeta ou vórtex antes do pulso de alta voltagem para garantir a mistura do DNA. Qualquer agregação das células provocará arco elétrico e reduzirá a eficiência de transformação.Em seguida, transfira a mistura para uma cubeta com eletrodo de 0,2 centímetro previamente resfriada. Novamente, tenha cuidado para não introduzir bolhas na mistura. Também para reduzir a formação de arcos elétricos.Certifique-se de que o exterior do QVE esteja completamente seco antes de colocá-lo na câmara de pulso. Após secar bem o QVE e com a resistência do controlador de pulso ajustada em mil ohms, coloque o QVE na câmara de eletroporação. Em seguida, após ajustar a tensão para 2,5 quilovolts, aplique o pulso até que um bip seja ouvido, indicando que o capacitor no QVE foi descarregado.Uma constante de tempo maior que 10 indicará uma eletroporação bem-sucedida. Eletroporações malsucedidas geralmente são indicadas por arco elétrico, o que causa uma faísca, o que muitas vezes pode ser evitado. Alterando a resistência no controlador de pulso, coloque o Q vet de volta no gelo por 10 minutos.Após a incubação, transfira a suspensão celular para um frasco universal estéril contendo cinco mililitros de caldo lemko TW. É importante diluir as células pelo menos dez vezes imediatamente após o pulso, para ajudar na recuperação celular e aumentar a sobrevivência dos transformantes. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por duas a três horas e, após a incubação, colha as células por centrifugação a 3000 ×g por 10 minutos, momento em que estarão prontas para serem semeadas.Após a centrifugação, faça uma diluição apropriada da suspensão em caldo lemko, de modo que cada placa receba de 30 a 300 colônias. É importante garantir que as colônias resistentes tenham se originado de uma única célula; portanto, certifique-se de que as células estejam completamente ressuspendidas antes da semeadura. Se as células não forem diluídas, pode ser muito difícil visualizar colônias verdadeiramente resistentes contra um fundo em forma de gramado de células sensíveis; agora, plaque as células em ágar lemko com o antibiótico apropriado.Eles incubam as placas a 37 graus Celsius até que as colônias fiquem visíveis. Isso levará de três a cinco dias após o crescimento das colônias. Conte os transformantes.Para calcular a eficiência de transformação. Vários fatores afetam a eficiência da transformação. Eles incluem a fase de crescimento das células no momento da colheita, o meio de eletroporação e a intensidade do campo e a constante de tempo do pulso aplicado.A eficiência da técnica de eletroporação também depende da escolha do DNA para transformação e, às vezes, da escolha do marcador selecionável. Obtemos rotineiramente eficiências de 10 à quinta a 10 à sexta colônias por micrograma de DNA, utilizando resistência à higromicina ou à estreptomicina em ems magma. Agora, para cultivar os transformantes, faça um esgotamento das micobactérias eletroporadas em meio sólido acrescido de agente seletivo.Incubar com antibiótico a 37 graus por dois a três dias. Após a incubação de dois a três dias, é possível analisar os transformantes conforme necessário para a maioria das aplicações; devem ser realizados três streaks e análises. É importante verificar a identidade do plasmídeo extracromossômico após a transformação.Como deleções e rearranjos são comuns, acabei de mostrar como eletrolisar o mycobacterium s magma. Se você for realizar este procedimento com microrganismos patogênicos, lembre-se de adotar medidas de segurança apropriadas. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Stefan, A., et al., Os benefícios multifacetados da co-expressão de proteínas em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento para transformar Escherichia coli com um plasmídeo portador de um gene de resistência a antibióticos, incluindo preparação celular, eletroporação, recuperação e seleção de transformantes.

Preparação e transformação de bactérias usando eletroporação de alta tensão

Comece com tubos contendo o estágio persistente não replicante, ou NRP, de Mycobacterium tuberculosis, que possui uma camada externa espessada.Adicione esferas de vidro a um tubo e agite-o para desestabilizar mecanicamente a camada externa das micobactérias, aumentando a permeabilidade.Em seguida, transfira a suspensão micobacteriana batida pela esfera para um tubo novo.Adicione rifampicina marcada fluorescente, um antibiótico antituberculose, tanto às suspensões celulares não tratadas quanto...

Avaliação da permeabilidade da camada celular em Mycobacterium tuberculosis persistente não replicante

A electroporação é um método vulgarmente utilizado para a introdução de ADN em bactérias, num processo conhecido como transformação. Protocolos tradicionais para a preparação de células electrocompetentes são demorados e trabalhosos. Este artigo descreve uma alternativa, rápida e eficiente método para a preparação de células electrocompetentes atualmente empregadas por alguns laboratórios.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

Este protocolo descreve o método CTAB para extrair DNA de alta qualidade de micobactérias, superando desafios causados por suas paredes celulares resistentes e ricas em ácido micólico. O processo envolve digestão enzimática, lise celular com CTAB e purificação do DNA por meio de extração orgânica e precipitação de etanol. Esse método produz DNA adequado para estudos moleculares e é confiável para pesquisas micobacterianas.

Extração de Ácido Desoxirribonucleico de Genoma Integral de Espécies de Mycobacterium via Técnica de Brometo de Cetiltrimetilamônio

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda a técnica de eletroporação para transformação de micobactérias usando Mycobacterium smegmatis. Este método otimizado supera a barreira da parede celular espessa, permitindo introdução eficiente de DNA em pesquisas de microbiologia.

Eletroporação de Micobactérias

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