Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

Olá, sou Maya Sibu Bloom do Instituto de Genética Humana e do Instituto de Células-Tronco do Nordeste da Inglaterra na Universidade de Newcastle. E isto é da Faculdade de Medicina de Wisconsin. Hoje vamos mostrar nosso procedimento para preparar Al Explan a partir de folículos viscerais de camundongos.

B Explan são o tecido inicial para o preparo de culturas de células-tronco neurais da crista neural epidérmica. Este procedimento envolve a dissecação do coxim vibrissal e a microdissecação dos folículos pilosos, seguidas pelo isolamento das BULs e seu posicionamento em uma placa de cultura. Vamos começar.

Este procedimento começa com a dissecação da saliência dos folículos pilosos das vibriças de camundongos adultos. Normalmente, utilizamos camundongos com idade entre dois e seis meses; no entanto, camundongos mais jovens tendem a fornecer um maior número de células-tronco. Os animais são anestesiados e completamente submersos em uma mistura na proporção um para um de Betadine e peróxido de hidrogênio por cerca de três minutos para desinfecção, posteriormente borrifando-se todo o camundongo, especialmente a região facial, com etanol a 75% e levando-o ao microscópio de dissecação.

No capuz de fluxo laminar, dissecar cuidadosamente as almofadas WHI, evitando cortar os bulbos pilosos, e colocá-las em solução salina balanceada em temperatura ambiente. Para dissecar os folículos WHI, segurar a pele ao lado do folículo com pinça e, em seguida, cortar ao redor do folículo com tesoura reta. Cortar profundamente.

Para evitar lesar os bulbos capilares, levante o folículo do bigode fora do coxim do bigode e coloque-o em uma nova placa. Com HBSS fresco, puxe os folículos na mesma placa. Fixe um folículo capilar com tesoura afiada e agulhas sobre uma placa de Petri de vidro revestida com seda contendo HBSS.

Lave o tecido adiposo solto e o tecido dérmico com jatos de tampão até que o folículo do vibrissa esteja limpo. Se necessário, corte o nervo do folículo do vibrissa e remova o tecido aderente raspando e fazendo lavagens repetidas com HBSS. Corte longitudinalmente o folículo visco com uma microlâmina.

Evite cortar muito profundamente, pois isso lesará a saliência. Remova qualquer sangue com lavagens repetidas de HBSS até que desapareça. O aparecimento de sangue é um bom indicador de que o corte foi suficientemente profundo.

Em seguida, faça um corte transversal acima do nível do seio conesso e, posteriormente, um segundo corte transversal ao nível do seio anelar, bem próximo à pele, na porção isolada do folículo. Agora você verá a saliência no interior da cápsula. Veja, aqui está ela.

Segure uma extremidade da cápsula com a pinça e remova a dilatação. Agora você verá a cápsula vazia e a poça isolada de dilatações. Coloque as dilatações isoladas em uma placa de cultura separada em HBSS à temperatura ambiente.

Certifique-se de que nenhum outro tecido esteja contaminando os bulbos agrupados. Neste ponto, os bulbos podem ser cultivados antes da cultura em plantas bulbo. As placas de cultura de 35 milímetros são revestidas com colágeno colocando gotas de 50 microlitros de colágeno e 10 microlitros estéreis.

Solução salina a 6% uma ao lado da outra. Misture bem com uma pipeta duplamente curvada e empurre em direção à borda da placa de cultura; incubar durante a noite em um ambiente limpo, mas sem deixar secar. Utilizamos um dessecador com uma placa de água na parte inferior para essa finalidade.

No dia seguinte, dia do cultivo, lave as placas com solução salina, pré-incube as placas de cultivo revestidas com colágeno e lavadas por aproximadamente três horas. Com meio de cultivo no incubador, o meio de cultivo é composto por 85% MEM modificado alfa, 10% soro bovino fetal e 5% extrato de embrião de pintinho do dia 11.

Após a pré-incubação, remova o meio de cultura das placas e adicione várias BULs com o mínimo possível de meio. Remova o excesso de meio de cultura. Incube por uma hora em incubadora celular em atmosfera umidificada com 10% de oxigênio e 5% de CO2.

Após uma hora, adicione lentamente 1,5 mililitro de cultura. Plantas médias CHE devem aderir ao substrato de colágeno; substitua 50% do meio de cultura diariamente. Ok, agora vamos lá.

E agora, uma análise das culturas. Em três a quatro dias, células altamente migratórias migrarão a partir dos agregados esféricos. Observe sua morfologia estelar e a ausência predominante de contatos entre células.

Nos próximos dias, mais células emigrarão e as células já emigradas proliferarão rapidamente, incluindo células raras importantes com morfologia achatada, cuja presença torna-se às vezes aparente vários dias após as células da crista neural epidérmica. Células-tronco são ocasionalmente observadas nestes cultivos. Essas células não são células-tronco da crista neural epidérmica, mas sim células-tronco epidérmicas putativas, menos móveis, ou progenitoras; cultivos constituídos por essas células devem ser descartados.

Acabamos de mostrar como preparar culturas de explantes bulbares que contêm células-tronco neurais epidérmicas. Como as células neurais são muito migratórias, elas deixarão o explante bulbar em três a quatro dias. Após o explante, a região de bulge é então removida e permanece, na placa de cultura, uma população pura de células neurais.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de desinfetar cuidadosamente o camundongo para evitar contaminação. Também é necessário cortar profundamente na almofada do risco para não lesar os folículos pilosos. Em relação aos cultivos, é importante diferenciar entre o sobrenadante migratório, as células da crista neural e os queratinócitos não migratórios com formato de calçada.

Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.