Name: Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-09T01:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco EPI-NCSC de folículos de bigode de camundongos usando microdissecção e cultura de tecidos. Este método permite estudar propriedades das células da crista neural em neurociência.

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Apoiado por: USPHS conceder NS38500, Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, NIH, EUA; Alliance Tecnologia Biomédica da Southeastern Wisconsin, Milwauke, WI, EUA; Bryon Paralysis Foundation Riesch, Milwaukee, WI, EUA; Ordem Fraternal de Eagles, Centro-Oeste Capítulo , EUA; National Spinal Cord Injury Association, Capítulo Milwaukee, EUA; North East England Stem Cell Institute, da Universidade de Newcastle, no Reino Unido.

Dissecção do Bulge de Folículos Whisker Adulto rato <ol><li> Usamos 10 semanas a 6 meses ratos velhos. Ratos mais jovens, muitas vezes produzir mais células. Euthanize rato e animal submerge inteiro em 1:01 mistura de betadine (solução de iodo) e peróxido de hidrogênio (disponível em farmácias) para cerca de 3 minutos. </li><li> Squirt do mouse todo, especialmente a região facial, com etanol 75%, e levar o mouse para microscópio de dissecção em capela de fluxo laminar. </li><li> Dissecar almofadas bigode, evitando cuidadosamente corte em bulbos capilares e piscina em HBSS. </li><li> Dissecar folículos bigode e piscina em HBSS à temperatura ambiente. Fazer isso, mantendo a pele junto ao folículo piloso com uma pinça, e depois corte em torno do folículo com a tesoura reta. Cortar profundamente para evitar ferir os bulbos de cabelo. </li><li> Levante folículo whisker fora do bloco de bigode e colocado em placa de novo com HBSS fresco. </li><li> Lave adiposo frouxo e tecido dérmico com esguichos de tampão, até que os folículos whisker estão limpos. Se necessário, corte coragem de folículo bigode e remover o tecido aderente por raspagem e flushes repetida de HBSS. </li><li> Pin follilce cabelo limpo para Sylgard revestido prato de vidro Petri utilizando agulhas de tungstênio afiadas, usando micropinças para se agarrar a parte da pele ao lado do folículo. </li><li> Whisker corte folículo longitudically com um MicroBlade. Evitar o corte muito fundo, pois isso irá prejudicar a protuberância. Remoção de sangue com jatos repetida de HBSS até ido. Aparecimento de sangue é uma boa indicação de que o corte foi profundo o suficiente. Se o corte longitudial não é suficientemente longo, pode ser alongado com microtesoura dobrados. </li><li> Faça um corte transversal acima do nível do seio cavernoso e, posteriormente, um segundo corte transversal ao nível do anel no interior do seio, perto da pele. </li><li> Você vai ver agora a protuberância dentro da cápsula. </li><li> Pegar um final de à cápsula de colágeno com a pinça e roll out do bojo com uma agulha de tungstênio dobrados. Você vai ver agora a cápsula vazia e isolada do bojo. </li><li> Piscina isolada protuberâncias em uma placa de cultura separados em HBSS à temperatura ambiente. Certifique-se de qualquer outro tecido está contaminando as protuberâncias pool. </li></ol> Cultura de explantes bojo <ol><li> 35 placas de revestimento milímetros cultura com colágeno colocando 50 mL de colágeno e 10 ml estéril NaCl 6% ao lado do outro. Misture bem com uma pipeta Pasteyr duplo dobrado e empurrar para a borda da placa de cultura. Incubar durante a noite em um dessecador limpo, mas não deixe secar. Antes do uso, lavar as placas com solução salina. </li><li> Pré-incubar colágeno revestido e lavadas placas de cultura por aproximadamente 3 horas com meio de cultura. Meio de cultura é composto por 85% de alfa-MEM modificado, 10% de soro fetal bovino e 5% dia 11 extrato de embrião de galinha. </li><li> Depois de re-incubação, remova o meio de cultura a partir de chapas e adicionar várias protuberâncias com o meio o menos possível. Remova o meio de cultura em excesso. </li><li> Incubar por 1 hora, mas não mais, na célula incubadora em uma atmosfera com oxigênio umidificado 10% e 5% CO 2. </li><li> Após 1 hora, gentilmente adicionar 1,5 ml de meio de cultura. Explantes bojo devem aderir ao substrato de colágeno. Substituir 50% do meio de cultura diária. </li><li> Dentro de 3-4 dias, as células altamente migratórias vai emigrar de explantes bojo. Nota sua morfologia estreladas, motilidade e ausência predominante de célula-contatos. Ao longo dos próximos dias, mais células vão emigrar, e emigrou células irão proliferar com rapidez. </li><li> Remover bojo 2-3 dias após o início da EPI-NCSC emigração com uma agulha de tungstênio afiadas. Se as protuberâncias ficam mais tempo, eles tendem a achatar e tornar impossível a obtenção de pura EPI-NCSC culturas. </li><li> Importante: Rare células com morfologia achatada, que se tornam, por vezes, aparente vários dias mais tarde do que EPI-NCSC, e quais são menos móveis NÃO são EPI-NCSC, mas putativo de células-tronco da epiderme / progenitores. Culturas consistindo destas células, ou culturas mistas contendo EPI-NCSC e putativo de células-tronco da epiderme / progenitores precisam ser descartados. </li><li> Dica: Não manter as células por muito tempo em meio explante primário, como eles tendem a diferenciar rapidamente em alta densidade celular, supostamente devido a autócrina / parácrina de sinalização do fator de crescimento. </li></ol>

<ol><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., YF, H. u, Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Grim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+hair+follicle+-+cradle+for+pluripotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+%28Part+C%29%22%5BJournal%5D)">The adult hair follicle - cradle for pluripotent neural crest stem cells.</a> Birth Defects Research (Part C). Tuan, R., Grim, M. 72, 162-172 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Schnell, L., Grim, M., Schneider, R., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+grafts+in+the+lesioned+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Pub%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) grafts in the lesioned spinal cord.</a> Pub. 32, 67-81 (2006).</li>
<li>Hu, Y. F., Zhang, Z. -J., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) molecular signature.</a> Stem Cells. 24, Epub ahead of print 2692-2702 (2006).</li>
</ol>

Em virtude da sua capacidade migratória, EPI-NCSC pode ser isolado como uma população altamente puro de células-tronco, que podem ser expandidos in vitro. Como restos embrionários em um local adulto, EPI-NCSC são candidatos potencialmente atraente para futuras terapias com células de substituição, engenharia biomédica e / ou medicina regenerativa. Nós testamos EPI-NCSC em um modelo do rato de lesão da medula espinhal, onde eles mostram características desejáveis. Através do perfil de expressão gênica por LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / geo...

rato epidérmico neural stem cell crest (epi-ncsc) culturas

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC são remanescentes da crista neural embrionária em um local adulto, o bojo dos folículos pilosos. Eles são células-tronco multipotentes que têm a propriedade fisiológica de gerar uma grande variedade de tipos de células diferenciadas, inclusive neurônios, células nervosas de apoio, células musculares lisas, osso / células de cartilagem e melanócitos. EPI-NCSC são facilmente acessíveis na pele aveludada e podem ser isoladas como uma população altamente puro de células-tronco. Este vídeo fornece um protocolo detalhado para a preparação do mouse EPI-NCSC culturas de folículos bigode. A almofada de bigode de um rato adulto é removido, e os folículos whisker dissecados. Os folículos são então cortadas longitudinalmente e, posteriormente, transversalmente acima e abaixo da região bojo. A protuberância é removida a cápsula de colágeno e colocados em uma placa de cultura. EPI-NCSC começam a emigrar de explantes bojo 3-4 dias depois.

Aqui nós mostramos o nosso método para isolar do mouse epidérmicas células da crista neural haste (EPI-NCSC). Técnica envolve a micro-dissecando folículos bigode, isolando o bojo e placeing-lo em cultura de tecidos. EPI-NCSC começam a emigrar a partir de explantes saliência para o substrato dentro de 3-4 dias.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

As EPI-NCSC são remanescentes da crista neural embrionária em uma localização adulta, a protuberância dos folículos pilosos. São células-tronco multipotentes que possuem a...

Olá, sou Maya Sibu Bloom do Instituto de Genética Humana e do Instituto de Células-Tronco do Nordeste da Inglaterra na Universidade de Newcastle. E isto é da Faculdade de Medicina de Wisconsin. Hoje vamos mostrar nosso procedimento para preparar Al Explan a partir de folículos viscerais de camundongos.B Explan são o tecido inicial para o preparo de culturas de células-tronco neurais da crista neural epidérmica. Este procedimento envolve a dissecação do coxim vibrissal e a microdissecação dos folículos pilosos, seguidas pelo isolamento das BULs e seu posicionamento em uma placa de cultura. Vamos começar.Este procedimento começa com a dissecação da saliência dos folículos pilosos das vibriças de camundongos adultos. Normalmente, utilizamos camundongos com idade entre dois e seis meses; no entanto, camundongos mais jovens tendem a fornecer um maior número de células-tronco. Os animais são anestesiados e completamente submersos em uma mistura na proporção um para um de Betadine e peróxido de hidrogênio por cerca de três minutos para desinfecção, posteriormente borrifando-se todo o camundongo, especialmente a região facial, com etanol a 75% e levando-o ao microscópio de dissecação.No ca

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve o método utilizado para o isolamento de neuroprecursors desenvolvimento do córtex de ratos embrionárias. O procedimento para a remoção de embriões do útero, dissecando o tecido cortical, e digerindo o córtex cerebral isolado é mostrado.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Para cultivar células-tronco da crista neural (NCSC) in vitro, um meio especial (NCSCM) é necessária. Parte essencial da NCSCM é extrair pinto embrião (CEE). Nós aqui descrever as técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE, incluindo detalhes como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos.

Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

Este artigo apresenta um protocolo robusto para isolamento e cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos.

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso...

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Crista neural (CN), as células derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) tem um grande potencial para a modelagem de desenvolvimento humano e de doenças e para terapias de substituição celular. Aqui, uma adaptação livre de alimentador do atualmente...

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) permite que os cânceres se tornem invasivos. Para investigar a EMT, é descrito um modelo in vitro baseado em células-tronco neurais (NSC) desprovido de soro e enzimas. Este sistema padronizado permite a avaliação quantitativa e qualitativa da migração celular, expressão gênica e proteica. O modelo é adequado para a descoberta de medicamentos.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Este protocolo descreve a dissecção e a cultura de pilhas neurais cranianas da crista dos modelos do rato, primeiramente para o estudo da migração da pilha. Nós descrevemos as técnicas ao vivo da imagem latente usadas e a análise da velocidade e da forma da pilha muda.

Dissecção, cultura e análise de células da crista neural craniana primária do mouse para o estudo de delaminação e migração de células de crista neural

Apresentamos um protocolo de diferenciação in vitro tridimensional (3D) gerando neuroesferas de tamanho reprodutível para produzir células da crista neural craniana a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. Mostramos que essa metodologia reduz a variabilidade em comparação com os protocolos anteriores e como ela pode ser usada para ensaios multiplexados para estudar o desenvolvimento das células da crista neural craniana.

Células de crista neural craniana tridimensionais in vitro protocolo de diferenciação para ensaio multiplexado

Aprenda a isolar células-tronco EPI-NCSC de folículos de bigode de camundongos usando microdissecção e cultura de tecidos. Este método permite estudar propriedades das células da crista neural em neurociência.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

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