Evolução Molecular do Recombinase Tre

Meu nome é Frank Alz. Sou líder de grupo no Instituto Maxx Plunk de Biologia e Genética Celular Macular, em Dresden. E vou falar agora sobre o nosso trabalho para desenvolver recombinases específicos de sítio para cirurgia molecular.

Basicamente como uma ferramenta capaz de excisar sequências predefinidas do genoma, e mais especificamente, tentar erradicar células infectadas pelo vírus HIV. Assim, basicamente, excisar o provírus HIV do genoma de células infectadas. Outro conceito é que adaptamos uma ferramenta genética já bem estabelecida, a saber, a recombinase Cre, para ligar, reconhecer e utilizar um sítio alvo que pré-definimos.

Portanto, propusemo-nos verificar se seria possível criar uma recombinase específica de sítio, que se ligue a um sítio presente naturalmente na LTR de um vírus HIV. E se fosse possível fazer isso, preveríamos que então seria viável excisar o provírus do genoma. Basicamente, o ciclo vital do vírus passa por uma fase em que o vírus se integra nas células e, por meio de uma transcrição reversa, produz um molde de DNA, que é delimitado por duas repetições terminais.

São chamados de repetições terminais longas ou LTRs curtas. Em seguida, isso é levado para o núcleo e integra-se mais ou menos aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Assim, você tem agora uma situação em que existe um chamado provírus, que está integrado e é flanqueado por duas repetições terminais longas, ou seja, por dois LTRs.

O conceito, agora, era que, se fôssemos capazes de criar uma recombinase que reconhecesse uma sequência existente no LTR, deveríamos ser capazes de excisar o provírus como um ciclo do genoma do hospedeiro e, assim, erradicar o vírus das células. Essa era a ideia conceitual. Bem, a recombinase é, na verdade, uma proteína que se liga ao DNA e encontra um sítio muito específico.

Portanto, ele possui um domínio de ligação ao DNA, que reconhece uma determinada sequência dentro do DNA. E somente quando encontra essa sequência exata é que a enzima se torna ativa. Ela não é ativa em nenhuma das outras sequências.

Os princípios da evolução molecular são basicamente conhecidos por qualquer pessoa, pois não passam de um processo de seleção. Assim, um princípio da evolução molecular é que você introduz mutações e, em seguida, realiza um processo de seleção, escolhendo uma determinada característica. É o mesmo que ocorre quando se faz melhoramento de plantas.

Você sabe que deseja um tamanho específico ou uma cor específica, e então sempre seleciona novamente para a progênie da próxima geração aquelas que possuem certas características e começa a cruzá-las entre si. É exatamente a mesma coisa que fazemos com moléculas. Então, é basicamente tudo isso, mas em pequena escala.

Então, começamos com uma enzima que possui uma certa atividade, no nosso caso a recombinase CRE, e com uma proteína do tipo selvagem. Em seguida, introduzimos uma leve mutação no sítio ao qual essa recombinase se liga, mas que ainda apresenta atividade muito, muito, muito baixa. Então, introduzimos mutações aleatórias na enzima, na recombinase, e selecionamos mutantes que agora são capazes de se ligar a esse sítio mutado.

Uma vez que temos isso, podemos então combinar os diferentes mutantes entre si para finalmente obtermos o produto final desejado, de modo que a recombinase reconheça a sequência que definimos na LTR. Assim, começamos, como disse, com uma biblioteca de mutagênese aleatória. Isso é tipicamente feito por PCR com erro induzido.

Portanto, utilizamos condições de PCR nas quais a polimerase, por exemplo, comete muitos erros. Dessa forma, geramos uma biblioteca aleatória que carrega mutações em diversos locais. Também podemos usar uma linhagem mutadora, uma linhagem bacteriana mutadora, que induz e introduz muitas mutações em certos transcritos.

E estes são então utilizados como material inicial. A outra tecnologia que utilizamos é, após certo tempo, a recombinação de DNA. Essa é basicamente uma tecnologia que permite combinar diferentes mutações benéficas, pois você realmente não sabe qual das mutações é benéfica, mas terá diferentes mutantes com mutações distintas.

Então, você tem um gene que possui uma mutação aqui, a qual é benéfica. Você tem um segundo clone que possui uma mutação aqui, e, para reunir essas duas mutações, realiza agora uma fragmentação aleatória das diferentes partes e, em seguida, as combina em uma reação de PCR para remontar os produtos. E agora, com certa frequência, você terá uma combinação das duas, na qual parte da recombinação é proveniente deste mutante e parte é proveniente daquele mutante.

E então, este aqui terá um efeito adicional que melhorará e permitirá, você será capaz de selecionar muito mais rapidamente os candidatos que possuem as propriedades desejadas. Assim, eu definiria que a proteína selvagem não possui absolutamente nenhuma atividade em um determinado sítio. Por exemplo, se tomarmos nossa sequência selecionada da LTR, da LTR do HIV, e testarmos a cre recombinase na sequência, não haverá absolutamente nenhuma atividade.

A recombinase CRE não é capaz de recombinar o sítio, e você tem uma nova recombinase por definição, eu diria, quando então possui uma enzima capaz de ligar e recombinar esta sequência. Nós não predefinimos quantos ciclos iríamos realizar, mas realizamos tantos ciclos quantos fossem necessários até obtermos uma enzima com a atividade desejada. Assim, começamos com mutações muito pequenas no sítio e depois passamos a combinar as diferentes mutações entre si.

Este foi um dos passos importantes que explicam por que esse processo estava funcionando. Assim, passamos por intermediários e tivemos que realizar vários ciclos para encontrar uma enzima que fosse ativa o suficiente para prosseguir para o próximo ciclo. É muito semelhante a qualquer processo de seleção genética.

Você estabelece uma determinada atividade que deseja, uma característica específica que quer, e então começa a reprodução. E até que obtenha o que desejava, você ainda não chegou lá e precisa realizar mais gerações. Basicamente, é nisso que consiste.

Devo também mencionar que os 120 ciclos de evolução, ou cento e vinte e oito, para ser exato, apenas identificaram um passo intermediário em que dissemos: agora podemos parar porque temos alguma atividade. As recombinações que temos atualmente ainda são menos ativas do que a recombinase CRE no seu sítio tipo selvagem. Portanto, para obter uma recombinase mais ativa, teríamos que realizar mais ciclos de evolução.

Então, basicamente, não termina onde estamos agora no processo de evolução. Não vejo limitações técnicas. É questionável até onde se pode levar isso.

Assim, as sequências LTR do lado L, ou seja, a sequência encontrada na LTR HA, compartilham 50% de similaridade de sequência com a sequência natural do lado P, o lado natural que a recombinase reconhece. Portanto, surge a pergunta: será possível avançar ainda mais? Ainda não sabemos isso, mas o fato de termos apenas 50% de similaridade de sequência com o sítio do tipo selvagem sugere que é possível levar isso ainda mais longe. A recombinase funciona bem em culturas de células humanas, embora, como mencionei, sua atividade não seja tão alta quanto a da recombinase query no seu sítio específico.

Então, provavelmente a estabilidade é um pouco menor do que a da recombinase da consulta, a enzima tipo selvagem, sendo necessárias mais seleções e mais ciclos de evolução para aprimorar essas características no futuro. Assim, o primeiro passo é aprimorar o sítio, essa recombinase específica, a três recombinases, tornando-a mais ativa, talvez encontrar outros sítios que sejam sítios proeminentes, que seriam bons alvos em um LTR, e encontrar uma recombinase muito boa para isso. Em seguida, seria necessário testar essa recombinase em diferentes ensaios, primeiro novamente em células de cultura de tecidos, mas então, de forma muito importante, testar essa recombinase em modelos animais.

Portanto, teríamos de verificar se esta recombinase possui quaisquer efeitos colaterais indesejáveis em um organismo. E, é claro, um aspecto muito desafiador é desenvolver um bom sistema de entrega para essa recombinase, o que não é trivial. E é uma área inteira de pesquisa por si só a ser desenvolvida.

Era basicamente uma abordagem de terapia gênica que teríamos de adotar. Bem, acho que estamos assistindo a uma mudança na medicina, tornando-se cada vez mais molecular. E, para isso, é claro, precisamos de ferramentas que nos permitam trabalhar nessa escala.

E é aí que vejo para onde caminha o futuro do processo evolutivo. Portanto, precisamos criar enzimas personalizadas que atuem em um processo que realmente gostaríamos de poder utilizar; no caso da recombinase, talvez seja possível considerar isso uma analogia a uma ferramenta para um cirurgião que precise remover cirurgicamente, durante uma operação, algo que ele precisa excisar. Assim, agora precisamos de ferramentas nas quais um cirurgião molecular possa, basicamente, excisar especificamente um determinado segmento de DNA do genoma.

E, para isso, ele precisa das ferramentas para poder realizar isso. Assim, a evolução molecular pode basicamente cumprir essa função. Muitas enzimas existem na natureza, as quais possuem propriedades muito desejáveis para poder fazer isso.

E nós apenas precisamos adaptá-los de acordo com nossas necessidades, para que possamos torná-los úteis. E acho que a evolução molecular pode desempenhar um papel muito importante aqui. Até onde vão as limitações é difícil dizer no momento, porque a tecnologia, este campo, ainda está realmente em sua infância.

Portanto, o tempo dirá quais são as limitações. Tenho certeza de que haverá algumas, mas no momento atual, acho que há mais oportunidades do que limitações reais.