Entrevista: HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved

Sou JohE Hvar e estou indo para o Departamento de Biologia Celular e Biologia, no Instituto HE Pet em Hamburgo, Alemanha. O Instituto HE PET é um instituto de pesquisa básica que se concentra exclusivamente em vírus patogênicos humanos, e sim, em questões relacionadas, eu diria. Assim, o nosso departamento tem como principal interesse investigar a regulação da expressão gênica do HIV e a interação, particularmente a interação intracelular do HIV com componentes da célula hospedeira.

Com base nesses dados, também tentamos desenvolver terapias experimentais novas e inovadoras para a doença causada pelo HIV. O problema com o HIV é que ele é um retrovírus ou lentivírus, e como todo retrovírus, o HIV integra, após a infecção da célula hospedeira, o genoma viral ao genoma da célula hospedeira. Até o momento, não é possível se livrar do provírus integrado.

Isso significa que, em termos de terapia, estamos falando de uma doença crônica com tratamento vitalício e, basicamente, com todos os problemas associados a terapias de longa duração, como efeitos colaterais dos medicamentos, surgimento de resistência e assim por diante. Bem, durante muitos anos, na pesquisa básica, conhecemos as chamadas recombinases, naturalmente presentes em processos de recombinação como em leveduras ou em bactérias, por exemplo. Essas recombinases reconhecem sequências específicas de DNA e promovem a troca de genes e a reorganização do genoma, entre outros processos.

E particularmente uma recombinase chamada CRE recombinase é usada na pesquisa básica e in situ na pesquisa básica. E o CRE basicamente reconhece sua sequência específica. E se você tiver uma sequência localizada entre dois sítios de reconhecimento, o CRE é capaz de excisar a sequência intercalada, basicamente.

Portanto, a ideia, já existente há 10 ou 15 anos, é, por um lado, da medicina erradicar o vírus e, por outro lado, utilizar, por exemplo, uma recombinase como a Cre para excisar o provírus. O DNA, isso deveria ser teoricamente possível porque, após a infecção, o HIV realiza a transcrição reversa do seu genoma de RNA em DNA e, devido a esse processo de transcrição reversa, sequências chamadas repetições terminais longas (LTRs) são geradas e marcam basicamente a extremidade 5' ou início e a extremidade 3', ou seja, o fim do provírus integrado no DNA. Assim, em teoria, se fosse possível desenvolver um sistema de recombinação tríplice que reconhecesse especificamente uma sequência nas LTRs, a recombinase atacaria basicamente a extremidade 5' e a extremidade 3' do provírus integrado, excisaria o DNA e, essencialmente, erradicaria o vírus da célula infectada. Agora, o problema com o HIV é que temos diferentes isolados, talvez até mesmo em um único indivíduo, um único paciente; no entanto, particularmente conforme sabemos até agora, a sequência nas extremidades inicial e final do genoma viral é conservada.

Em outras palavras, as LTRs são mais conservadas do que, por exemplo, os genes do HIV. Então, acredito que há uma boa chance de conseguirmos utilizar apenas alguns poucos números de recombinância que basicamente reconheçam a grande maioria de todos os isolados do HIV. E, caso contrário, teremos basicamente que gerar um novo por evolução molecular, o que no futuro pode ser semi automatizado.

E isso acontecerá, o processo será muito mais rápido do que fazê-lo no laboratório. Aqui entra nosso colega, o Dr. Frank, do Instituto Max Splunk. Basicamente, ele é um especialista em recombinase e em tudo mais.

Basicamente, o que ele utilizou é o que chamamos de método de evolução molecular. Mas o método é baseado na tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR). E ele utiliza o gene da recombinase naturalmente ocorrente, degree combs, e monta uma reação de PCR ou múltiplas reações de PCR em condições que introduzem, de forma aleatória, mutações.

E o truque agora é selecionar as novas versões da recombinase que adquiriram uma nova capacidade ou atividade, ou seja, reconhecer sequências específicas do HIV. E ele faz isso em ciclos iterativos. Ele levou cerca de 120 ou mais de 120 ciclos para realizar esse tipo de método de evolução molecular.

Quando ele finalmente chegou a essa específica, agora chamada de três para a recombinação específica de LTR com essa nova recombinação que agora reconhece especificamente sequências do HIV. Assim, o estudo inicial aqui foi aquele em que os experimentos com os recombinantes foram realizados no Instituto HE PET, em Hamburgo. E o que fizemos, especialmente, foi entregar essa recombinação com vetores, vetores genéticos, em culturas celulares humanas que haviam sido infectadas com um isolado clínico, mais ou menos, do HIV-1.

E, com o tempo, ao longo de seis a oito semanas, conseguimos demonstrar isso. Agora, o recombinante é quantitativamente empolgante; eles integraram o perfil de HIV DA, basicamente toda a cultura é curada com a eliminação do HIV. Existem certamente inúmeros problemas com esta tecnologia.

Primeiramente, precisamos garantir que a expressão da recombinase não esteja causando efeitos colaterais tóxicos. Nós não, nós não esperamos isso porque, para recombinações naturalmente ocorrentes como gre, existem os chamados animais transgênicos. Eles expressam essa recombinação GRE e, bom, existem alguns problemas, mas não muito significativos.

Posso dizer isso neste momento. Portanto, há esperança de que não haja efeitos colaterais tóxicos, mas nunca se sabe até que se realizem os experimentos. E também existem problemas que talvez não permitam reconhecer todos os isolados clínicos, de modo que possamos nos livrar do isolado dominante, o isolado de HIV em um paciente.

Mas vamos selecionar, ao longo do tempo, a partir de isolados menores. Isso é, não sabemos, temos que realizar esses experimentos. Então, há um grande problema com a entrega gênica, com a tecnologia de vetores.

Devemos usar os chamados vetores lentivirais ou também vetores retrovirais para entregar o gene ou o gene da recombinase. Então, existem efeitos colaterais? Existem, esses vetores provocam efeitos tóxicos?

Essas são todas as perguntas que temos. Além disso, esperamos melhorar a atividade dos pentes. Eles, a recombinação está atuando mais rapidamente do que a observamos atualmente, em algumas semanas, a atividade.

Portanto, estas são todas perguntas em aberto que precisamos desenvolver nos próximos anos. E este é agora certamente o problema, porque as recombinases não estão disponíveis por via oral. Assim, não haverá uma pílula, uma pílula de recombinase, simplesmente assim, e você se livra do vírus.

Portanto, embora especulando sobre terapias futuras, precisamos considerar abordagens de terapia gênica. Talvez seja possível imaginar que isolamos as chamadas células-tronco hematopoiéticas ou células CD34 positivas do sangue de pacientes infectados pelo HIV. Em seguida, no laboratório, introduzimos o gene para os combs nessas células do paciente.

Por fim, reintroduzimos, reinjetamos as células do paciente, ou seja, infundimos novamente as células geneticamente modificadas de volta ao mesmo paciente. O que deveria acontecer é que, com o tempo, o sistema imunológico ou o sistema hematopoético do paciente seja pelo menos parcialmente reconstituído por células que, ao serem infectadas pelo HIV, sejam capazes de eliminar o vírus, pois agora expressam uma recombinase. Assim, o efeito seria uma redução na carga viral do paciente, o que certamente melhoraria a qualidade de vida.

E também podemos esperar que o sistema imunológico esteja se reconstituindo nesses pacientes, pelo menos parcialmente. Assim, agora, a, a, a função, as, as células imunes que são totalmente funcionais, elas serão capazes, esperançosamente, de atacar as células infectadas remanescentes nesses pacientes. Se realmente podemos ou não erradicar completamente o HIV de um paciente, isso não podemos afirmar neste momento.