Entrevista: HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved

Eu sou JohE Hvar e estou indo para o Departamento de Biologia Celular e Biologia, o HE Pet Institute em Hamburgo, Alemanha. O HE PET Institute é um instituto de pesquisa básica com foco exclusivo em pe humano, vírus patogênicos e sim, e questões relacionadas, eu diria. Portanto, nosso departamento está interessado principalmente em investigar a regulação da expressão gênica do HIV e na interação na interação particularmente intracelular do HIV com componentes da célula hospedeira.

Com base nesses dados, também tentamos desenvolver terapias novas e experimentais para a doença do HIV. O problema com o HIV é que o HIV é um retrovírus ou lentivírus e, como todo retrovírus, o HIV se integra após a infecção da célula hospedeira, o genoma viral no genoma da célula hospedeira. Até agora, não se pode mais se livrar do provírus integrado.

Isso significa que, em termos de terapia, estamos falando de uma doença crônica com uma terapia vitalícia e basicamente com todos os problemas relacionados às terapias ao longo da vida, como efeitos colaterais dos medicamentos, ocorrência de resistência e assim por diante. Bem, por muitos anos na pesquisa básica, conhecemos a chamada recombinase, ocorrendo naturalmente em recombinações como em leveduras ou bactérias, por exemplo. E essas recombinações são sequências de DNA específicas reconhecidas e embaralham genes e reorganizam o genoma e assim por diante.

E particularmente uma recombinase chamada recombinação decre é usada na pesquisa básica e a situ na pesquisa básica. E o CRE está basicamente reconhecendo sua sequência específica. E se você tiver uma sequência localizada entre dois locais de reconhecimento, o CRE é capaz de extirpar a sequência intermediária basicamente.

Então a ideia já há 10 ou 15 anos é do remédio erradicar o vírus e por outro lado, usar como recombinase como luto, por exemplo, para extirpar o perfil. DNA, isso deve ser em teoria possível porque, após a infecção, o HIV transcreve reversamente, seu genoma RA em DNA e, devido a essa sequência do processo de transcrição reversa chamada de longas repetições terminais, são geradas e marcam basicamente os cinco bris ou o início e a borda de borda livre, o fim do perfil integrado D.So em teoria, se alguém pudesse chegar a uma recombinação de três, que re reconhece especificamente em uma sequência no LTR, então seria, o discordo basicamente atacaria as cinco extremidades primárias e a extremidade BRI livre do perfil integrado, o DNA extirparia o DNA e basicamente erradicaria o vírus da célula desinfetada. Agora, o problema com o HIV é que temos diferentes isolados talvez também em, em, em uma, em uma única pessoa, um único paciente, no entanto, particularmente como sabemos até agora, a sequência está no início e no final do vírus do genoma viral.

Então, em outras palavras, os LTRs são mais conservados do que, por exemplo, os genes do HIV. Portanto, acho que há uma boa chance de conseguirmos apenas alguns números de recombinance que basicamente reconhecem a vasta maturidade de todos os isolados de HIV. E se não, basicamente temos que gerar um novo por evolução molecular, que pode ser no futuro semi-autotomizado.

E vai, o processo será muito mais rápido do que fazê-lo no laboratório. Em nosso colega, o Dr. Frank do Instituto Max Splunk entrou no final do quadro. Basicamente, ele é um especialista em recombinase e tudo mais.

Basicamente, o que ele usou é o que chamamos de método de evolução molecular. Mas o método é baseado na tecnologia de reação em cadeia de polímeros de PCR. E ele pega o gene dos favos de grau de recombinase que ocorrem naturalmente e configura uma PCR ou múltiplas reações de PCR em condições que introduzem mutações de forma aleatória.

E o truque agora é selecionar as novas versões da recombinase que adquiriram uma nova capacidade ou nova atividade, ou seja, reconhecer sequências específicas do HIV. E ele está fazendo isso em ciclos reiterados. Ele, ele, ele levou cerca de 120 ou mais de 120 ciclos para fazer esse método molecular, esse tipo de evolução molecular.

Quando ele finalmente surgiu com esse específico, agora chamado de três para recombinance específico LTR com esta nova recombinance que agora está reconhecendo especificamente as sequências do HIV. Portanto, o estudo inicial aqui foi o, o, os experimentos com os recombinantes foram realizados aqui no Instituto HE PET em Hamburgo. E o que fizemos foi especialmente entregar essa recombinance com vetores, vetores genéticos em cultura de células humanas que haviam sido infectadas com um isolado mais ou menos clínico de H HIV V.

E com o tempo, ao longo de seis a oito semanas, conseguimos demonstrar isso. Agora, o recombinante é excitante quantitativamente, eles integraram o perfil do HIV DA, basicamente toda a cultura é curada ao se livrar do HIV. Certamente existem inúmeros problemas com essa tecnologia.

Em primeiro lugar, temos que nos certificar de que a expressão da recombinase não está causando efeitos colaterais tóxicos. Nós não, não esperamos isso porque para recombinações que ocorrem naturalmente como gre, existem os chamados animais transgênicos. Eles expressam essa recombinação GRE e tudo bem, então há alguns problemas, mas não muito significativos.

Posso dizer isso neste momento. Portanto, há esperança de que não haja efeitos colaterais tóxicos, mas você nunca sabe quando terá que fazer os experimentos. E também há problemas que eu, talvez não reconheçamos todos os isolados clínicos com ele para que possamos nos livrar, do isolado dominante do HIV, em um paciente.

Mas vamos selecionar entre isolados menores e menores ao longo do tempo. Ou seja, não sabemos, temos que fazer esses experimentos. Depois, há um grande problema com a entrega do gene, com a tecnologia do vetor.

Temos que usar os chamados vetores lentivirais ou também vetores retrovirais para entregar o gene ou o gene recombinase. Então, existem efeitos colaterais? Existem, esses vetores estão causando efeitos tóxicos?

Estas são todas as perguntas que temos. Além disso, esperamos melhorar a atividade dos favos. Eles, a recombinação está agindo mais rápido do que vemos agora, algumas semanas, a atividade.

Portanto, todas essas são questões em aberto que temos que desenvolver nos próximos anos. E este é certamente o problema agora porque a recombinase não está disponível por via oral. Portanto, não haverá pílula, pílula de recombinase bem, e você se livra do vírus.

Então, mas especulando sobre a terapia futura, temos que pensar em abordagens de terapia genética. Então, talvez se possa conceber que isolemos as chamadas células-tronco hematopoiéticas ou células CD34 positivas do sangue de pacientes infectados pelo HIV. E então, no laboratório, introduzimos o gene dos favos nas células desse paciente.

Finalmente, reintroduzimos, reinjetamos o paciente, controlamos, infundimos as células do paciente e agora elas modificaram geneticamente as células do paciente nas costas do mesmo paciente. Então, o que deve acontecer é que o sistema imunológico ou o sistema hematopoiético do paciente está, ao longo do tempo, pelo menos parcialmente se reconstituindo com células que, após a infecção pelo HIV, podem se livrar do vírus porque agora expressam uma recombinase. Portanto, o efeito seria que uma carga viral cairia no paciente, mas melhoraria a qualidade de vida, certamente.

E também podemos esperar que o sistema imunológico esteja se reconstituindo nesses pacientes, pelo menos parcialmente. Então, agora, a função, as células imunológicas que estão totalmente funcionais, elas serão capazes de atacar as células infectadas restantes nesses pacientes. Se podemos ou não erradicar completamente o HIV de um paciente que nós, não podemos dizer neste momento.