Name: Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprenda a rotulagem de células estaminais embrionárias humanas com cloreto de manganês para ressonância magnética. Este método utiliza canais de cálcio dependentes de voltagem e oferece sinal positivo superior ao óxido de ferro para rastrear células viáveis.

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Rotulagem de manganês de células estaminais embrionárias humanas <ol><li> Trypsinize as hastes embrionárias humanas que foram cultivadas no alimentador sem condições por 5 minutos. Neutralizar a tripsina, adicionando meios de cultura. </li><li> Girar as células por centrifugação a 800 rpm por 5 minutos a 20 ° Celsius. Após re-suspensão de células do sedimento, contar o número de células por trypan coloração azul. Com base na contagem de células obtidas, divide as células em quatro alíquotas de 3 milhões de células em tubos cônicos. Agregar as células novamente por centrifugação. </li><li> Pouco antes de iniciar a rotulagem de manganês, dissolver o cloreto de manganês fresco com solução 0,9% de cloreto de sódio para fazer uma solução de cloreto de 0,1 mM de manganês. </li><li> , A fim de observar a atividade dos canais de cálcio, quatro amostras foram preparadas. A primeira amostra é de nosso controle que contém células incubadas em cloreto de sódio 0,9% sozinho. A segunda amostra contém células incubadas em 0,1 mM MnCl 2. Amostra 3 e 4 contêm células incubadas em 0,1 mM MnCl 2 com qualquer um dos 5 mM de Ca 2 + canais agonista, (s )-(-)- Bay K8644, ou 250 mM de Ca 2 + canais antagonista, verapamil. Incubar as quatro amostras a 37 ° Celsius com 5% de CO 2 por 30 minutos. </li><li> Após 30 minutos, girar as células a 800 rpm por 5 minutos a 20 ° Celsius. Em seguida, aspire o sobrenadante e lavar a células marcadas duas vezes com PBS. Após a lavagem, re-suspender cada pellet com 200 mL de PBS e transferir para tubos de PCR. Essas pelotas são geralmente brancos. </li></ol> Rotulagem de ferro de células estaminais embrionárias humanas <ol><li> Mix clínico-grade sulfato de protamina com água destilada para obter uma solução estoque 1 mg / mL. </li><li> Em um tubo contendo-tronco embrionárias humanas meios de cultura de células, adicionar ferumoxides a 100 mcg / mL seguido pela adição de 12 mcg / mL sulfato de protamina. Misturar a solução vigorosamente por cinco minutos. </li><li> Adicionar solução mista para a mesma quantidade de meios de cultura celular para obter uma concentração final de 50 mcg / mL de ferumoxides e 6 mcg / ml do sulfato de protamina para as células rótulo. Incubar as células nessa solução por 12 horas. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS, com a última lavagem contendo heparina 10U/ml de dissolver o complexo de sulfato extracelular ferumoxides-protamina. Após a lavagem, trypsinize células para obter uma suspensão única célula. </li><li> Contar as células e alíquotas para o número necessário de amostras. Após a lavagem, re-suspender cada pellet com 200 mL de PBS e transferir para tubos de PCR. Estas pelotas deve ser laranja escuro na cor marrom. </li></ol> Realizar Ressonância Magnética Cellular <ol><li> Faça um fantasma, a fim de estabilizar os tubos contendo os pellets celulares e também para evitar artefatos a partir do ar circundante durante a digitalização. Para isso, mistura 0,8% de ágar e 1% de sulfato de cobre em água destilada e trazê-la para ferver por microondas por 5-7 minutos. Legal essa mistura durante pelo menos 1 hora antes de digitalizar para atingir um gel. </li><li> Os tubos contendo os pellets celulares rotulados são colocados no fantasma para a digitalização. Celulares in vitro MRI é realizada em Signa HDX 3T MRI (GE Medical Systems), utilizando bobina de joelho clínico. </li><li> Varredura as células de manganês rotulados para cada uma das três amostras utilizando uma seqüência spin echo: TR, tempo de repetição = 800 ms. TE, tempo de eco = mínimo, FOV, campo de visão = 12 x 12 cm; matriz = 256x256, NEX 1. </li><li> Varredura as células de ferro rotulados usando uma seqüência gradiente-eco. Usamos os seguintes parâmetros para esta imagem: TR = 100 ms; TE = 10 ms, FA; ângulo de inclinação = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matriz = 256 x 256, NEX 1. </li></ol> Analisando os resultados da RM <ol><li> Analisar imagens de ressonância magnética de 4 diferentes amostras de células-manganês rotulados: <ul><li> Amostra n º 1 é nosso controle que contém células incubadas em cloreto de sódio 0,9% sozinho. </li><li> Amostra # 2 contém células incubadas em 0,1 mM MnCl 2. </li><li> # 3 da amostra contém células incubadas em 0,1 mM MnCl 2 com 5 mM de Ca 2 + canal-agonista, (s )-(-)- Bay K8644. </li><li> Amostra # 4 contém células incubadas em 0,1 mM MnCl 2 com 250 mM de Ca 2 + canal-antagonista, verapamil. </li></ul></li><li> Como previsto, as diferenças na intensidade do sinal de manganês células marcadas são visíveis. Em comparação com as células rotuladas puramente com o manganês, a intensidade do sinal claramente aumenta na presença do agonista dos canais de cálcio e diminui na presença de antagonista dos canais de cálcio. A área onde a intensidade do sinal aumentou de manganês células marcadas são medidos usando Image J (NIH, Bethesda, MD, EUA). O mesmo software é usado para analisar a área de sinal fora de ressonância escuro de ferro células marcadas. O tamanho do sinal escura do ferro-rotulados células depende do número de células ou o número de partículas de ferro contido pelas células. Neste caso, Um milhão de células mostra uma área menor sinal escura em comparação com o sinal a partir dos três milhões de células. </li></ol>

<ol><li>Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-calcium+interactions+with+contrast+media+for+cardiac+magnetic+resonance+imaging%3A+a+study+of+manganese+chloride+supplemented+with+calcium+gluconate+in+isolated+Guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts.</a> Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).</li>
<li>Aoki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+for+magnetic+resonance+imaging+with+the+T1+agent+manganese+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride.</a> NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li>
<li>Arbab, A. S., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MRI+and+its+role+in+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular MRI and its role in stem cell therapy.</a> Regen Med. 3, 199-215 (2008).</li>
</ol>

Estes resultados indicam que o manganês não entra através do canal de cálcio voltagem-dependentes, e manganês pode ser usado como agente de contraste para IRM, que também pode mostrar a viabilidade celular. Portanto, sugerimos que o manganês guiada ressonância magnética pode ser útil para monitorar a viabilidade das células após o transplante de células estaminais embrionárias humanas no miocárdio.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de manganês tetraidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>(S)-(-)-Bay K8644 </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B133</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de verapamil (+), titulação mínima de 99,0%</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio 0,85-0,90% p/v</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>VW 3257-1</td><td></td></tr><tr><td>Feridex I.V.</td><td>Reagente</td><td>Berlex Laboratories</td><td>NDC 59338-7035-5</td><td>solução injetável de ferumoxides 11,2 mg de ferro/mL</td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Reagente</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td>NDC 63323-229-05</td><td>50 mg (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Knockout SR (substituto sérico para células ES)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>2-mercap&amp;#8211;etanol 98+%</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 3148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM 100x</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 10.000 unidades/mL</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução 100x de aminoácidos não essenciais MEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Signa HDx 3T MRI</td><td>Ferramenta</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bobina clínica para joelho</td><td>Ferramenta</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr></tbody></table>

na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para ressonância magnética

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Células estaminais embrionárias humanas (CTEh) demonstraram a capacidade de restaurar o miocárdio lesado. A ressonância magnética (MRI) emergiu como uma das modalidades de imagem predominante para avaliar a recuperação do miocárdio lesado. Além disso, os agentes ex-vivo rotulagem, tais como nanopartículas de óxido de ferro, têm sido empregados para rastrear e localizar as células-tronco transplantadas. No entanto, este método não monitora uma propriedade biologia celular fundamental em relação à viabilidade das células transplantadas. Tem sido conhecido que o cloreto de manganês (MnCl 2) entra nas células através de voltagem dependentes de cálcio (Ca 2 +) canais quando as células são biologicamente ativos, e acumula intracelularmente para gerar T efeito encurtamento 1. Portanto, sugerimos que o manganês guiada ressonância magnética pode ser útil para monitorar a viabilidade das células após o transplante de CTEh no miocárdio. Neste vídeo, vamos mostrar como rotular CTEh com MnCl 2 e como essas células podem ser claramente vistos usando MRI in vitro. Ao mesmo tempo, a atividade biológica de Ca 2 +-channels será modulada utilizando tanto Ca 2 + canal-agonistas e antagonistas para avaliar as alterações do sinal concomitante.

Neste vídeo, estamos mostrando como rotular células estaminais embrionárias humanas (CTEh) com cloreto de manganês (MnCl<sub&gt; 2</sub&gt;), Que pode entrar nas células através dos canais de cálcio quando as células são biologicamente ativos. Além disso, mostramos o uso de MnCl<sub&gt; 2</sub&gt; Como agente de contraste celular ressonância magnética para determinar a viabilidade in vitro de CTEh.

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Células-tronco embrionárias humanas (hESC) demonstraram a capacidade de restaurar o miocárdio lesionado. A imagem por ressonância magnética (IRM) surgiu como uma das...

A Ressonância Magnética ou RM surgiu como uma modalidade de imagem predominante para localizar células-tronco transplantadas e para compreender melhor o mecanismo de regeneração. Esses estudos de RM geralmente utilizam nanopartículas de óxido de ferro como agente de contraste por imagem. No entanto, as partículas de ferro podem permanecer no tecido após a morte das células-tronco e podem ser absorvidas por macrófagos, resultando em condições subótimas para o rastreamento das células transplantadas viáveis.Este vídeo demonstrará que o cloreto de manganês é uma alternativa eficaz. A marcação com agente de contraste utilizando cloreto de manganês oferece várias vantagens em comparação com a marcação com óxido de ferro. Por exemplo, o manganês produz um sinal positivo, enquanto partículas de íons geram um sinal negativo.Além disso, sabe-se que o íon manganês entra nas células por meio de canais de cálcio dependentes de voltagem. Assim, sua presença na ressonância magnética indica células viáveis e biologicamente ativas. Olá, sou Uni Mother do laboratório de Philip Yang, da divisão de medicina cardiovascular da Universidade de Stanford.Hoje vou mostrar como marcar células-tronco embrionárias humanas com manganês para a imagem por ressonância magnética. Este procedimento inclui as seguintes etapas: marcar células-tronco embrionárias humanas com agentes de contraste, realizar imagem por ressonância magnética celular in vitro e analisar os resultados de RNM. Então, vamos começar.O primeiro passo no procedimento de marcação é preparar células-tronco embrionárias humanas, que foram cultivadas em condições livres de soro fetal. Para isso, trypsinize as células por cinco minutos, em seguida neutralize a tripsina adicionando meio de cultura. Em seguida, centrifugue as células a 800 RRP M por cinco minutos a 20 graus Celsius.Após suspender a amostra celular em PBS, conte o número de células por triplicata com coloração azul de tripano e, com base na contagem celular obtida, divida as células no número necessário de alíquotas em tubos cônicos. Neste caso, estou dividindo as células em quatro alíquotas de 3 milhões de células. Centrifugue novamente a amostra celular imediatamente antes de iniciar o marcador com manganês; dissolva cloreto de manganês fresco em cloreto de sódio 0,9% para preparar uma solução de cloreto de manganês 0,1 milimolar.Para observar a atividade dos canais de cálcio, preparamos as amostras. A primeira amostra é o nosso controle, que contém células incubadas apenas em cloreto de sódio a 0,9%. A segunda amostra contém células incubadas em cloreto de manganês 0,1 milimolar; as amostras três e quatro contêm células incubadas em cloreto de manganês 0,1 milimolar com cinco micromolares do agonista do canal de cálcio AK 8 6 44 ou 250 micromolares do antagonista do canal de cálcio.A seguir, incube as quatro amostras a 37 graus Celsius com 5%CO2 por 30 minutos. Após 30 minutos, centrifugue as células a 800 RPM durante cinco minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, aspire o sobrenadante e lave as células marcadas duas vezes com PBS. Após a lavagem, suspenda cada pellet em 200 microlitros de PBS e transfira para tubos de PCR.Essas placas geralmente são brancas. Pronto, concluímos o preparo das células marcadas com manganês para fins comparativos. Também prepararemos células utilizando os métodos mais tradicionais de marcação com ferro, iniciando assim a marcação com ferro.Adicione sulfato de protamina grau clínico de Nick à água destilada para obter uma solução estoque de um miligrama por mililitro. Em seguida, no tubo contendo o meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas, adicione óxido de filme a cem microgramas por mililitro combinado com o sulfato de protamina a 12 microgramas por mililitro. Em seguida, misture a solução por cinco minutos.Após misturar a solução, adicione-a às suas células usando um volume igual da solução misturada e do meio de cultura celular para obter uma concentração final de 50 microgramas por mililitro de óxido e seis microgramas por mililitro de sulfato de protamina. Incube as células por 12 horas; após 12 horas, lave as células duas vezes com PBS, sendo a última lavagem contendo 10 unidades por mililitro de heparina para dissolver o complexo extracelular de sulfato de proteína de óxido. Após a lavagem, trypsinize as células para obter uma suspensão simples de células, em seguida conte as células e distribua no número necessário de amostras.Neste caso, estou preparando uma amostra com 1 milhão de células e outra com 3 milhões de células. Em seguida, as células P, essas pastilhas devem apresentar coloração laranja, marrom. Por fim, ressuspendemos cada pastilha com 200 µL de PBS e transferimos para tubos de PCL.Ok, terminamos a marcação das células. Vamos prosseguir com a imagem de ressonância magnética celular. Para iniciar a aquisição de imagens, primeiro preparamos um fantoma com o objetivo de estabilizar os tubos contendo as paletas celulares e também de evitar artefatos provenientes do ar circundante durante a varredura.Para isso, misture 1% de sulfato de cobre e 0,8% de ágar em água destilada e aqueça em forno de micro-ondas por cinco a sete minutos até ferver. Essa mistura é então resfriada por pelo menos uma hora para obter um gel. Em seguida, os tubos contendo os pellets celulares marcados são colocados no fantoma para varredura.A RM celular in vitro é realizada com um scanner de 3,0 T utilizando uma bobina clínica de joelho. Utilizamos o Signa fabricado pela GE Medical Systems para escanear as células marcadas com manganês para cada uma das quatro amostras, usando uma sequência de eco de spin. Os parâmetros para a sequência foram determinados a partir do mapeamento T previamente estudado das células marcadas.Utilizamos um tempo de eco no mínimo com um tempo de repetição de 800 milissegundos, campo de visão de 12 por 12 centímetros, matriz 256 por 256. Próximo. Em seguida, escaneie as células marcadas com ferro utilizando uma sequência de eco de gradiente.Utilizamos os seguintes parâmetros para esta aquisição de imagem: tempo de eco de 10 milissegundos, tempo de repetição de cem milissegundos, ângulo de inclinação de 30 graus, campo de visão de 12 por 12 centímetros, matriz de 256 por 256 e o próximo.Ok, terminamos todo o processo de imageamento. Agora vamos analisar os resultados. Abaixo estão os resultados da varredura por RNM de quatro amostras diferentes de células marcadas com manganês.A amostra número um é o nosso controle, que contém células incubadas apenas em cloreto de sódio a 0,9%. A amostra número dois contém células incubadas em cloreto de manganês 0,1 milimolar. A amostra número três contém células incubadas em cloreto de manganês 0,1 milimolar com cinco micro do agonista do canal de cálcio vacay 8 6 4 4.O número quatro da amostra contém células incubadas em 0,1 milhão MO de cloreto de manganês com 250 micro mouroa do antagonista do canal de cálcio véu. Em comparação com as células marcadas apenas com manganês, a intensidade do sinal aumenta na presença do agonista do canal de cálcio e diminui na presença do antagonista do canal de cálcio. A área de aumento do sinal para as células marcadas com manganês é medida utilizando o Image J. Esses resultados indicam que o manganês realmente entra através do canal de cálcio regulado por voltagem.Agora vamos comparar esses resultados com os obtidos a partir das células marcadas com ferro. Observe a diferença entre o sinal positivo brilhante das células marcadas com manganês e o sinal negativo escuro das células marcadas com ferro. Acabamos de demonstrar como realizar a marcação com manganês de células-tronco embrionárias humanas para imagem por ressonância magnética celular in vitro.Este procedimento é um método eficaz para rastrear células-tronco porque, primeiro, um manganês pode ser facilmente introduzido nas células por meio de uma simples incubação de 30 minutos. Segundo, as células marcadas com manganês fornecem imagens nítidas com um sinal positivo, e terceiro, o manganês entra nas células através do canal de cálcio regulado por voltagem, conforme demonstrado pelo uso de agonistas e antagonistas dos canais de cálcio, e, portanto, só entra nas células viáveis. Por conseguinte, acreditamos que a marcação com manganês de células-tronco embrionárias humanas possui grande potencial para a ressonância magnética celular in vivo precisa, a fim de rastrear o efeito de células-tronco embrionárias humanas transplantadas em áreas lesadas isquêmicas.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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