Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

A elegância do mar é um organismo modelo incrivelmente útil devido ao nosso conhecimento de suas linhagens celulares, bem como à riqueza de informações produzidas por ter sequenciado e analisado todo o seu genoma. Neste vídeo, demonstramos o processo de microinjeção de plasmídeos no sea elegance e a seleção de descendentes transgênicos usando microscopia fluorescente como um animal transparente e multicelular, o sea elegance é ideal para visualizar transgenes expressando proteínas marcadas com fluorescência in vivo. Olá, meu nome é Laura Berkowitz e sou pesquisadora associada do Laboratório Caldwell do Departamento de Ciências Biológicas aqui na Universidade do Alabama.

E eu sou Adam Knight, também do Calwell Lab da Universidade do Alabama. Hoje mostrarei como se preparar e realizar a microinjeção de plasmina para gerar elegância marítima transgênica, e mostrarei como selecionar e manter linhas de elegância de focas transgênicas. Então vamos começar.

Antes de começarmos a microinjeção, temos algumas etapas de preparação, que mostrarei agora. Primeiro, prepare o DNA do plasmídeo a ser injetado, são necessários dois plasmídeos, um que codifica a expressão específica do tecido de nosso gene de interesse e o segundo que fornece um marcador de transformação selecionável. Misturar os plasmídeos numa proporção de um para um de 50 nanogramas por microlitro.

A cada seguida, prepare almofadas helicoidais, que serão usadas para imobilizar os vermes para injeção. Para fazer as almofadas do sem-fim, coloque primeiro vários vidros de cobertura de 22 por 50 milímetros na bancada. Usando uma pipeta de pastagem, coloque uma gota de 2%agros derretido em uma tampa de vidro e imediatamente coloque uma segunda tampa de vidro sobre a gota em um ângulo de 90 graus em relação à primeira.

Deixe o aero solidificar por alguns segundos e, em seguida, remova o vidro da tampa superior. O diâmetro do disco achatado do aero deve estar entre 15 e 20 milímetros. Como um animal de estimação, deixe a almofada secar completamente por várias horas ou durante a noite.

Depois de secos, guarde as almofadas em uma caixa de vidro de cobertura em temperatura ambiente. Em seguida, prepare os carregadores de agulhas para a solução de DNA. Para fazer isso, pegue um tubo capilar de cem microlitros e aqueça-o no meio de uma chama aberta e puxe-o rapidamente para aproximadamente o dobro de seu comprimento.

Assim que o tubo capilar esfriar, separe as duas metades. Armazene de 10 a 20 carregadores de agulhas para injeção. Você pode armazená-los na vertical em um tubo de microcentrífuga.

Brack, tenha cuidado. As pontas do carregador de agulhas são muito afiadas. Agora faça as agulhas de micro injeção.

Essas agulhas são feitas de um tubo capilar especial que contém um filamento de vidro interno. Este filamento serve como um pavio para a solução de DNA. Para fazer as agulhas, usamos um Niki PP oito 30 Polar Com uma configuração de calor de 24,8, várias agulhas são puxadas ao mesmo tempo para armazenamento.

Várias agulhas podem ser montadas em uma tira de massa de modelar. Pequenos cacos de vidro de cobertura serão usados para abrir a ponta da agulha puxada. Esses cacos são preparados envolvendo uma lamínula de 18 por 18 milímetros em um lenço Kim e aplicando pressão suavemente até que se quebre em vários pedaços.

Use fragmentos com aproximadamente três por quatro milímetros de tamanho. Além de preparar o DNA e as agulhas, prepare cerca de 50 a 100 devidamente estadiados. Dois vermes do tipo selvagem para cada construção de vetor de expressão a ser injetada.

Agora estamos prontos para configurar o microscópio de microinjeção. Para começar a configurar o microscópio, abra a válvula principal no tanque de hélio que está conectada ao braço e suporte da agulha de microinjeção. Feche o regulador para permitir que o gás entre na linha.

Trazendo a pressão para 35 PSI, o gás pode ser liberado usando um pedal. Em seguida, insira um carregador de agulhas em um tubo de pipetador de boca padrão e coloque uma pequena quantidade da mistura de plasmídeo aproximadamente um microlitro. Agora insira suavemente o carregador até o fim da agulha de microinjeção até sentir resistência.

Expulse a solução de DNA soprando suavemente e remova o carregador. Uma vez carregado o DNA, insira a agulha no braço de microinjeção, tendo o cuidado de colocá-la dentro da pequena junta interna de borracha e, em seguida, prenda-a ao braço do manipulador. Em seguida, coloque um fragmento de vidro de cobertura de quebra de agulha em uma borda de uma almofada de trado.

Cubra o fragmento, bem como toda a superfície da almofada do sem-fim com óleo de carbono sagrado. Em seguida, coloque a almofada do sem-fim no palco de um microscópio invertido. Depois que a almofada do sem-fim estiver no lugar, posicione a agulha no centro do campo de visualização usando a objetiva Forex e a iluminação do campo brilhante, mas ainda não a abaixe no óleo.

Em seguida, posicione a borda interna do caco de vidro de cobertura no centro e concentre-se nela. Abaixe a agulha no óleo, colocando-a no mesmo plano focal do caco de vidro de cobertura. Aumente a ampliação alternando para a objetiva de 40 x e, em seguida, concentre-se novamente na borda do fragmento e reposicione a ponta da agulha, se necessário.

Agora abra a ponta da agulha de injeção. Empurre suavemente a agulha contra a borda do caco de vidro de cobertura e, ao mesmo tempo, aplique um pulso curto de gás por meio do pedal. A agulha será suficientemente aberta.

Quando pequenas gotículas de líquido escapam do final do fluxo de líquido excessivo da agulha devido ao excesso de grande, uma abertura não é desejável, pois matará os animais. Assim que a agulha estiver pronta, iniciamos a microinjeção. Em seguida, remova a almofada do sem-fim do palco levantando a agulha.

Mas não altere a posição do eixo X ou Y. Deslize o stage por baixo da agulha. Remova a almofada do sem-fim e coloque-a em um microscópio de dissecação.

Transfira uma palavra para a almofada abaixo da superfície do óleo. Se o verme se contorcer suavemente até entrar em contato com a almofada do sem-fim, o verme úmido deve aderir ao agro seco. Coloque rapidamente a almofada do sem-fim de volta no palco, centralizando o verme no campo de visão.

Em seguida, abaixe a agulha no mesmo plano de foco do verme. Mude os filtros no osciloscópio invertido para iluminação Hoffman. Este filtro de contraste permite que os detalhes morfológicos do verme se tornem visíveis.

Usando a objetiva de 40 x, concentre-se no centro sensorial granulado da gônada do verme abaixo do padrão de favo de mel dos núcleos germinativos. Escolha a gônada posicionada no lado do verme voltado para a agulha. Multa. Ajuste a posição da agulha até que a ponta também esteja em foco.

Insira suavemente a agulha no centro da gônada e aplique um breve pulso de pressão de gás para expelir uma ou duas gotículas de DNA para o braço da gônada. Você deve observar uma onda de líquido espalhada pelo aguilhão distal com muita prática e habilidade. Você pode acertar o centro de aguilhão todas as vezes.

Lembre-se de que é importante trabalhar rapidamente ao injetar um verme. Como pode dessecar facilmente. Idealmente, todo o processo deve levar menos de um a dois minutos.

Assim que a injeção estiver concluída, remova a almofada do sem-fim do stage e coloque-a em um escopo de dissecação. Aplique um microlitro de tampão M nine diretamente no verme injetado. Isso pode envolver submergir a ponta da pipeta abaixo da superfície do óleo de carboidrato halo.

O tampão deve reidratar o verme e, em seguida, ele flutuará na superfície da almofada aeros, transferindo o verme para uma placa regular usando uma picareta de minhoca. Agora vou entregar os vermes injetados para Adam e ele nos mostrará a seleção e manutenção de linhagens transgênicas. Os vermes injetados são transferidos para placas individuais de 60 milímetros com sementes frescas e podem se reproduzir.

Esses worms representam a geração P zero. Normalmente, os animais injetados são incubados a 20 graus Celsius por dois a três dias até que a prole apareça. Assim que a prole aparecer, estamos prontos para começar a triagem de vermes transgênicos.

A prole F1 é observada quanto à evidência do marcador transgênico. Nesse caso, o marcador selecionável é fluorescente, para que possamos rastrear usando um microscópio estéreo fluorescente. Cada animal portador fluorescente F1 é clonado separadamente em uma nova placa.

O P zero injetado pode produzir apenas uma a cinco descendentes fluorescentes entre todos os seus F1. Permita que os hermafroditas F1 se reproduzam a 20 graus por dois a três dias até que a prole apareça. Uma vez que a geração F dois está pronta, eles também são observados para animais transgênicos. F dois animais que herdaram e expressaram um marcador transgênico são considerados uma linha estável.

Cada linha estável independente deve ser mantida como uma linha separada de vermes propaga cada linhagem, transferindo vários animais transgênicos para uma nova placa a cada geração. Isso deve ser realizado usando um microscópio estéreo fluorescente. Se o marcador selecionável for fluorescente para controlar a variabilidade no número de cópias do gene, gere um mínimo de três linhas estáveis independentes por construção injetada.

Acabamos de mostrar como microinjetar expressão, construções vetoriais e ver elgan e selecionar linhas estáveis. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.