Name: Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção para gerar C. elegans transgênicos estáveis. Este método permite visualizar expressão gênica com proteínas fluorescentes em um organismo modelo transparente e multicelular.

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Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. Pesquisa distúrbios do movimento no laboratório tem sido apoiado pela distonia Bachmann-Strauss &amp; Parkinson Foundation, Parkinson United Foundation, Parkinson Disease Association americana, doença de Parkinson Associação de Alabama, a Michael J. Fox Foundation for Research de Parkinson, e um de Iniciação Científica.

Construção expressão Plasmid Dois plasmídeos são necessários: um para o tecido-específicos a expressão do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionáveis. Experimental Plasmid <ol><li> Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, por exemplo, um nervo ou músculo-específicos promotor. Se uma é a de expressar genes múltiplos dentro do mesmo tecido, uma fita cassete promotor plasmídeo no sistema Gateway (Invitrogen) pode ser usado. Esta abordagem permite a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por 4 a clonagem recombinational. Geralmente, 2-5 kb de sequências a montante é suficiente para ter expressão correta e precisa. </li><li> O cDNA do gene de interesse pode ser clonado de duas maneiras: <ol><li> Clonagem convencional, usando enzimas de restrição. </li><li> Para clonagem Gateway, que é amplificado PCR usando primers que contêm o Gateway att seqüência B recombinational. O cDNA amplificado é primeiro recombinados no pDONR201 vetor doador para criar o vetor de entrada e depois transformado em E. coli DH5a tensão. Após a selecção de recombinantes de sucesso e mini-prep isolamento de DNA, o vetor de entrada é recombinados no vetor destino promotor contendo para criar a expressão plasmídeo. Detalhes sobre a clonagem recombinational estão disponíveis a partir de qualquer manual de gateway da Invitrogen ou em Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marcador selecionável Plasmid Exemplos de plasmídeos marcador transgênicos incluem rol-6 ou o uso do promotor de parede muscular do corpo unc-54 para dirigir a expressão da proteína fluorescente. Estes plasmídeos marcador normalmente estão disponíveis dentro da comunidade de pesquisa, mediante solicitação. Microinjeção de C. elegans Preparação <ol><li> Realizar o isolamento do DNA dos dois plasmídeos que estão a ser injetado. Quantificar-los e misturar na proporção de 1:1 de 50 ng / mL cada. </li><li> Prepare almofadas agar: <ol><li> Faça uma solução de 2% agarose em água, calor ou microondas até dissolver. </li><li> Estabelecidos vários 22 x 50 mm na tampa óculos de uma bancada. </li><li> Com uma pipeta Pasteur, colocar uma gota do agarose derretida em uma tampa de vidro e coloque imediatamente uma tampa de vidro, o segundo sobre a queda em um ângulo de 90 com o primeiro. Repita o procedimento para vários copos cobrir outro. O diâmetro do disco achatado de agarose deve ser entre 15-20 mm. </li><li> Após a agarose solidificou (este só tem momentos), retire a tampa de vidro e permitir que a almofada de ar para secar completamente (várias horas durante a noite). </li><li> Armazenar os blocos em uma caixa de vidro da tampa à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Faça carregadores de agulha para a solução de DNA: Carregadores de agulha são criados a partir de 100 l tubos capilares que são aquecidas no meio sobre uma flama aberta e rapidamente puxado para cerca de duas vezes o seu comprimento. As duas metades são agarrados à parte uma vez que o tubo capilar esfria. Estoque 10-20 carregadores agulha para a injecção. Guardar na posição vertical em um rack tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não empalar-se nos pontos. </li><li> Faça agulhas microinjeção: A agulha é feita a partir de um tubo especial capilar que contém um filamento de vidro interno; este filamento serve como um pavio para a solução de DNA. Essas são puxados em uma máquina de agulha extrator. Nós usamos um Narishige PP-830 com uma configuração extrator de calor de 24,8. Agulhas diversas são puxados em um momento e são armazenadas em uma pequena caixa de plástico. Várias agulhas podem ser facilmente &quot;montado&quot; em uma tira de massa de modelar para armazenamento de longo prazo. </li><li> Ponta da agulha &quot;breakers&quot;: A ponta da agulha microinjeção é puxado tão fina que é realmente fechado para ele final e deve ser quebrado usando cacos de vidro pequena tampa. Estes são preparados por um embrulho 18 x 18 mm de tampa de vidro um papel toalha e gentilmente aplicando pressão até que quebre em vários pedaços. Fragmentos de um tamanho útil é de aproximadamente 3 x 4 mm. </li><li> Crescer tipo selvagem (N2) worms para a fase adulta cedo para injeção usando procedimentos padrão 6. Prepare corretamente cerca de 100 encenou worms / construir injetado. </li></ol> Procedimento <ol><li> Abra a válvula principal em um tanque de hélio que está conectado a um braço e agulha microinjeção titular. Fechar a válvula reguladora para permitir que o gás entrar na linha, trazendo a pressão para 35 psi. Observe que o gás pode ser liberado através de um pedal. </li><li> Inserir uma agulha em um carregador de tubos padrão boca pipeta (encontrado em embalagens de tubos capilares de vidro) e elaborar uma pequena quantidade da mistura de plasmídeo (~ mL 1). </li><li> O carregador de agulha é cuidadosamente colocada na extremidade traseira de uma agulha de injeção e gentilmente inserido todo o caminho até o comprimento dea agulha até sentir resistência. Expulsar a solução de DNA por soprando suavemente, em seguida, retire o carregador. </li><li> Inserir a agulha no braço microinjeção, tendo o cuidado de colocá-lo dentro da junta de borracha pequena interna. </li><li> Coloque um pedaço de agulha quebra de vidro da tampa sobre uma extremidade de um bloco de ágar. Cobrir o shard, bem como toda a superfície do pad agar, com o petróleo halocarbonos. Coloque o bloco de ágar no palco de um microscópio invertido. </li><li> Posição da agulha no centro do campo de visão usando o objetivo de 4X e iluminação de campo claro, mas ainda não diminuí-lo para o óleo. Além disso, a posição da borda interna do caco de vidro no centro da capa, então o foco sobre ele (ainda usando objetivo 4X). Abaixe a agulha no petróleo, trazendo-o no mesmo plano focal como o caco de vidro da tampa. Elevar a ampliação mudar para a objetiva de 40X. Recentrar na borda do fragmento e reposicionar a ponta da agulha, se necessário. </li><li> Para abrir a ponta da agulha de injeção, cutucar gentilmente a agulha contra a borda da tampa de vidro caco, enquanto ao mesmo tempo, a aplicação de um pulso curto de gás através do pedal. A agulha vai ser suficientemente arrombado quando pequenas gotas de líquido escapar da ponta da agulha. Fluxo de líquido em excesso, devido à abertura de uma muito grande não é desejável, uma vez que irá matar os animais. </li><li> Remover o bloco de ágar do palco, levantando a agulha para cima, mas não altere a X ou eixo Y posição. Deslize o estágio de baixo da agulha, retire o bloco de ágar e colocá-lo em um microscópio de dissecação. Transferência de um worm para o bloco, abaixo da superfície do óleo. Se o verme se contorce, gentilmente acariciá-lo até que o bloco de contatos agar. O worm úmido devem aderir ao agarose seca. </li><li> Injeção <ol><li> Colocar rapidamente as costas pad agar para o palco, centrando o worm no campo de visão. </li><li> Abaixe a agulha no mesmo plano de foco como o worm. </li><li> Mudar os filtros para Hoffman Iluminação (um tipo de filtro de contraste). Isso permite que os detalhes morfológicos do verme para se tornar visível. Se Nomarski / DIC óptica estão disponíveis no âmbito invertido que vai funcionar tão bem. Usando a objetiva de 40X, o foco no centro de &quot;granulado&quot; sincicial da gônada worm, abaixo do padrão de &quot;favo de mel&quot; dos núcleos germinativas (escolher qualquer das gônadas é posicionado no lado do worm enfrentar a agulha). </li><li> Afinar a posição da agulha até que a ponta também está em foco (o mesmo plano que o &quot;grão&quot; gônadas). </li><li> Insira cuidadosamente a agulha no centro da gônada e aplicar um breve pulso de pressão de gás para expulsar uma gota ou duas de DNA no braço gonadal. Você deve observar uma onda de propagação de líquido através da gônada distal. Não assuma mais líquido é melhor, desde muito líquido pode fluir para dentro da curva proximal do braço gônadas, o que pode encerrar a produção de oócitos. Se possível, dependendo da posição do worm, injetar o braço gônadas outros da mesma maneira. </li><li> É importante trabalhar rapidamente, enquanto a injeção de um worm, pois ele pode facilmente desidratar. A decisão de injetar o braço gônadas segunda é dependente de como rapidamente você pode re-posicionar a agulha e worm. Todo o processo devem, idealmente, ter menos de 1-2 minutos. </li></ol></li><li> Remova a tampa de vidro do palco e colocá-lo em um escopo de dissecação. Aplicar 1μl de tampão M9 (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, NaCl 85mm, 1mM MgSO 4) diretamente sobre o worm injetado (isso implicaria submergindo a ponta da pipeta abaixo da superfície do óleo halocarbonos). O buffer deve hidratar o worm, que então flutuam na superfície pad agarose. Transferir o worm para um prato regular usando uma picareta worm. A almofada de agarose podem ser reutilizados várias vezes mais até que ela se tornou muito saturado com tampão e os vermes já não aderir. </li></ol> Seleção de transgênicos <ol><li> Worms injetada, a P 0 geração, são transferidos para nova individuais, placas de bactérias semeadas (60 mm) e permissão para reproduzir. Normalmente, os animais injetados são incubados a 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem. </li><li> A F 1 filhos são observados para a evidência do marcador de transgênicos (como fluorescência) usando um estereomicroscópio fluorescente. Cada operadora, fluorescente F 1, animal clonado é separado em um prato novo (já que a prole de cada F 1 são considerados uma linha distinta). A F 1 hermafroditas têm permissão para se reproduzir. Novamente, isso é normalmente realizada em menos 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem. </li><li> A geração F 2 é observado para os animais transgênicos também. F 2 animais que herdaram e expressar a matriz transgênicos são considerados uma linha de &quot;estável&quot;. NOTA: No 1 º Fidade pode haver muitos animais transgênicos, mas eles não são estáveis. A maioria dos animais transgênicos F 1 não serão propagadas em F 2 linhas estável. NOTA: Para controlar a variabilidade no número de cópias do gene, gerar um mínimo de três linhas independentes estável por construir injetado. </li><li> Cada linha independente e estável deve ser mantida como uma linha separada de vermes. Cada linha pode ser propagada através da transferência de vários animais transgênicos para um prato novo a cada geração, o que deve ser realizada em um estereomicroscópio fluorescentes se o marcador selecionável é fluorescente. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar-se de: - Injectar directamente no centro da gônada - Não injetar muito líquido - Trabalhar com rapidez para evitar dessecação. Se você tiver problemas com a agulha, tal como ela é quebrada muito grande, o melhor é remake de uma agulha fresco, ao invés de tentar injetar com menos de agulha ideal. A geração de worms transgênico tem muitas aplicações, tais como: - Identificação de genes mutantes, no método chamado de resgate de transformação - M...

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de Halocarbono, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de vidro 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de vidro 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de vidro 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de 100 µl</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de Vidro para Agulhas</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de Agulhas</td><td>Ferramenta</td><td>Narishige International</td><td>Modelo PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistema microINJECTOR</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Escopo, Platina, Manipulador</td></tr><tr><td>Dissecção, com Fluorescência</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Dissecção</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de transgênicos estável c. elegans usando microinjeção

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Elegans Caenorhabditis transgênicos podem ser facilmente criados através de microinjeção de uma solução de DNA plasmidial para o 1 gonadal. O DNA plasmidial se reorganizam para formar concatamers extracromossómicos que são herdados de maneira estável, embora não com a mesma eficiência como cromossomos reais 2. Um gene de interesse é co-injetado com um marcador fenotípico óbvio, como rol-6 ou GFP, para permitir a seleção de animais transgênicos sob um microscópio de dissecação. O gene exógeno pode ser expressa de seu promotor nativo para estudos de localização celular. Alternativamente, o transgene pode ser conduzido por um promotor diferentes tecidos específicos para avaliar o papel do produto do gene em que determinada célula ou tecido. Esta técnica eficiente drives expressão do gene em todos os tecidos de C. elegans, exceto para o embrião ou início de linha germinal 3. Criação de animais transgênicos é amplamente utilizado para uma série de paradigmas experimentais. Este vídeo demonstra o processo de microinjeção para gerar vermes transgênicos. Além disso, a seleção e manutenção de transgênicos estável C. elegans é descrita linhas.

Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

*Caenorhabditis elegans* transgênicos podem ser facilmente criados por meio da microinjeção de uma solução de plasmídeo de DNA na gônada 1. O DNA plasmidial reorganiza-se para...

A *C. elegans* é um organismo modelo incrivelmente útil devido ao nosso conhecimento sobre suas linhagens celulares, bem como à grande quantidade de informações obtidas a partir do sequenciamento e análise de todo o seu genoma. Neste vídeo, demonstramos o processo de microinjeção de plasmídeos na *C. elegans* e a seleção de descendentes transgênicos utilizando microscopia de fluorescência. Sendo um animal transparente e multicelular, a *C. elegans* é ideal para visualizar transgenes que expressam proteínas marcadas com fluorescência *in vivo*. Olá, meu nome é Laura Berkowitz e sou pesquisadora associada no Laboratório Caldwell, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama.E eu sou Adam Knight, também do Laboratório Calwell na Universidade do Alabama. Hoje vou mostrar a vocês como se preparar e realizar a microinjeção de plasmina para gerar linhagens transgênicas de *C. elegans*, e também como selecionar e manter linhagens transgênicas de *C. elegans*. Então, vamos começar.Antes de iniciarmos a microinjeção, temos algumas etapas de preparação, que mostrarei agora. Primeiro, prepare o DNA plasmidial a ser injetado; são necessários dois plasmídeos, um que codifica a expressão tecido-específica do nosso gene de interesse e o segundo que fornece um marcador de transformação selecionável. Misture os plasmídeos em uma proporção de um para um, de 50 nanogramas por microlitro.A seguir, prepare os suportes de parafuso helicoidal, que serão usados para imobilizar os vermes durante a injeção. Para fabricar os suportes de parafuso helicoidal, coloque inicialmente várias lamínulas de 22 por 50 milímetros sobre a bancada. Usando uma pipeta de Pasteur, coloque uma gota de ágar a 2% derretido sobre uma lamínula e, imediatamente, posicione uma segunda lamínula sobre a gota em um ângulo de 90 graus em relação à primeira.Deixe o aero solidificar por alguns segundos e, em seguida, remova a lamínula superior. O diâmetro do disco achatado de aero deve estar entre 15 e 20 milímetros. Como se fosse um animal de estimação, deixe a plaqueta secar ao ar completamente por várias horas ou durante a noite.Uma vez secos, armazene as lâminas em uma caixa de vidro de relógio à temperatura ambiente. Em seguida, prepare os carregadores de agulha para a solução de DNA. Para isso, pegue um tubo capilar de cem microlitros e aqueça-o no meio de uma chama aberta, puxando-o rapidamente até aproximadamente o dobro do seu comprimento original.Após o tubo capilar esfriar, quebre as duas metades separando-as. Estoque de 10 a 20 carregadores de agulha para injeção. Você pode armazená-los na posição vertical em um tubo de microcentrífuga.Brack, tenha cuidado. As pontas do carregador de agulhas são muito afiadas. Agora, prepare as microagulhas de injeção.Essas agulhas são feitas a partir de um tubo capilar especial que contém um filamento interno de vidro. Esse filamento atua como um pavio para a solução de DNA. Para fabricar as agulhas, utilizamos um puxador Niki PP eight 30 Polar com um ajuste de calor de 24,8, puxando várias agulhas de cada vez para armazenamento.Vários agulhas podem ser montadas em uma tira de massa de modelar. Pequenos fragmentos de lamínula serão usados para romper a ponta da agulha puxada. Esses fragmentos são preparados envolvendo uma lamínula de 18 por 18 milímetros em um lenço de papel Kim e aplicando suavemente pressão até que se quebre em várias partes.Utilize fragmentos com aproximadamente três por quatro milímetros de tamanho. Além de preparar o DNA e as agulhas, prepare cerca de 50 a 100 vermes adequadamente estagiados. Dois vermes do tipo selvagem para cada construto de vetor de expressão a ser injetado.Agora estamos prontos para configurar o microscópio de microinjeção. Para começar a montagem do microscópio, abra a válvula principal do tanque de hélio conectado ao braço e suporte da agulha de microinjeção. Feche o regulador para permitir que o gás entre na tubulação.Levando a pressão a 35 PSI, o gás pode ser liberado usando um pedal. Em seguida, insira um carregador de agulha em um tubo de pipetador bucal padrão e coloque uma pequena quantidade da mistura de plasmídeo, aproximadamente um microlitro. Agora, insira suavemente o carregador completamente através da agulha de microinjeção até sentir resistência.Expulse a solução de DNA soprando suavemente e, em seguida, remova o carregador. Uma vez que o DNA esteja carregado, insira a agulha no braço de microinjeção, tomando cuidado para posicioná-la dentro da pequena junta de borracha interna e, então, fixe-a ao braço do manipulador. Em seguida, coloque um fragmento de vidro de cobertura para quebrar agulhas em uma borda do suporte de rosca.Cubra o fragmento, bem como toda a superfície do suporte de auga, com óleo de carbono vazio. Em seguida, coloque o suporte de auga sobre a platina de um microscópio invertido. Depois que o suporte estiver posicionado, posicione a agulha no centro do campo de visão utilizando o objetivo Forex e a iluminação de campo claro, mas ainda não a abaixe até o óleo.Em seguida, posicione a borda interna do fragmento de lamínula no centro e, então, foque nela. Abaixe a agulha no óleo, trazendo-a para o mesmo plano de foco do fragmento de lamínula. Aumente a magnificação trocando para a objetiva de 40 x, refocuse na borda do fragmento e reposicione a ponta da agulha, se necessário.Agora, quebre a ponta da agulha de injeção. Empurre suavemente a agulha contra a borda do fragmento de lamínula, ao mesmo tempo em que aplica um breve pulso de gás por meio do pedal. A ponta da agulha será aberta adequadamente.Quando pequenas gotas de líquido escapam da ponta da agulha devido a um orifício excessivamente grande, o fluxo excessivo de líquido não é desejável, pois matará os animais. Uma vez que a agulha estiver pronta, iniciamos a microinjeção. Em seguida, remova o suporte de fixação do estágio elevando a agulha para cima.Mas não altere a posição dos eixos X ou Y. Deslize a platina para fora de sob a agulha. Remova o suporte da broca e coloque-o sobre um microscópio estereoscópico.Transfira um verme para a placa situada abaixo da superfície do óleo. Se o verme se contorcer suavemente, toque-o levemente até que entre em contato com a placa de agar, momento em que o verme úmido deverá aderir ao agar seco. Coloque rapidamente a placa de agar de volta sobre a platina, centralizando o verme no campo de visão.Em seguida, abaixe a agulha até o mesmo plano de foco do verme. Altere os filtros no microscópio invertido para iluminação Hoffman. Esse filtro de contraste permite que os detalhes morfológicos do verme se tornem visíveis.Usando a objetiva de 40 x, foque no centro sensorial granulado da gônada do verme abaixo do padrão em favo de mel dos núcleos germinativos. Escolha a gônada que estiver posicionada no lado do verme voltado para a agulha. Ajuste cuidadosamente a posição da agulha até que a ponta também esteja em foco.Insira suavemente a agulha no centro da gônada e aplique um breve pulso de pressão de gás para expelir uma ou duas gotas de DNA no braço da gônada. Você deve observar uma onda de líquido se espalhando pela gônada distal com muita prática e habilidade. Você pode atingir o centro da gônada todas as vezes.É importante lembrar que é necessário trabalhar rapidamente ao injetar um verme, pois ele pode desidratar-se facilmente. Todo o processo deve levar idealmente menos de um a dois minutos.Após a conclusão da injeção, remova o suporte do parafuso sem-fim do estágio e coloque-o em um microscópio estereoscópico. Adicione um microlitro de tampão M nove diretamente sobre o verme injetado. Isso pode exigir submergir a ponta da pipeta abaixo da superfície do óleo halo carb.O tampão deve reidratar o verme e, em seguida, ele flutuará na superfície do disco de aeros, transfira o verme para uma placa comum usando um palito para vermes. Agora vou entregar os vermes injetados ao Adam e ele nos mostrará a seleção e a manutenção das linhagens transgênicas. Os vermes injetados são transferidos para placas individuais de 60 milímetros, recém-semeadas, e deixados para se reproduzirem.Essas minhocas representam a geração P zero. Normalmente, os animais injetados são incubados a 20 graus Celsius por dois a três dias, até que a prole apareça. Assim que a prole surgir, estamos prontos para iniciar a triagem de minhocas transgênicas.A prole F1 é observada em busca de evidências do marcador transgênico. Neste caso, o marcador selecionável é fluorescente, portanto podemos realizar a triagem utilizando um microscópio estereoscópico de fluorescência. Cada animal F1 portador do marcador fluorescente é clonado separadamente em uma nova placa.O P zero injetado pode produzir apenas uma a cinco proles fluorescentes entre todos os seus F1. Deixe as hermafroditas F1 se reproduzirem a 20 graus por dois a três dias, até que a prole apareça. Quando a geração F2 estiver pronta, ela também é observada quanto a animais transgênicos. Animais F2 que herdaram e expressaram um marcador transgênico são considerados uma linhagem estável.Cada linhagem estável independente deve ser mantida como uma linhagem separada; propague cada linhagem transferindo vários animais transgênicos para uma nova placa a cada geração. Isso deve ser realizado utilizando um microscópio estereoscópico com fluorescência. Se o marcador selecionável for fluorescente, para controlar a variabilidade no número de cópias do gene, gere no mínimo três linhagens estáveis independentes por construto injetado.Acabamos de mostrar como microinjetar expressão, construtos de vetor e elgan e como selecionar linhagens estáveis. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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