O método MODS para o diagnóstico da tuberculose e da tuberculose resistente a múltiplas drogas

Para cada três pessoas no mundo, uma está infectada com tuberculose. O diagnóstico de tuberculose ativa previne novas infecções porque os pacientes com tuberculose ativa infectam entre 10 e 15 outras pessoas por ano até o momento em que são tratados ou morrem. Mods é um acrônimo que usamos para evitar ter que dizer observação microscópica, ensaio de suscetibilidade a medicamentos e o motivo pelo qual é chamado assim se tornará aparente à medida que a metodologia for explicada.

No pequeno vídeo, descreveremos a metodologia mods para o diagnóstico rápido e barato da tuberculose e da tuberculose multirresistente. O vídeo apresentará a metodologia passo a passo. Discutiremos as implicações de biossegurança de trabalhar com cultura líquida e também explicaremos algumas das importantes questões de garantia de qualidade necessárias para o uso dessa metodologia.

O ensaio mods foi desenvolvido na Universidade Kayana em Lima, Peru, no laboratório de Bob Gilman. Seguindo as observações inicialmente feitas por cavi solto. O LOOSE estava tentando identificar maneiras rápidas de detectar mycobacterium tuberculosis em culturas usando indicadores colormétricos.

Mas ela observou que a observação dessas culturas ao microscópio revelou a presença de crescimento de microbactérias vários dias antes de os indicadores colormétricos mudarem de cor, e foi com base nessa observação que o ensaio do MOD foi desenvolvido. O ensaio do MOD foi desenvolvido em um ambiente com recursos limitados e é direcionado a ambientes com recursos limitados, portanto, pouco menos de 3 por teste para detecção de TB e resistência a múltiplos medicamentos com base em cultura líquida. É extremamente atraente e, pela primeira vez, traz esse tipo de capacidade de diagnóstico para lugares onde os recursos são limitados.

Portanto, o ensaio mods é baseado em três princípios centrais. A primeira é que o Mycobacterium tuberculosis cresce em meio líquido muito mais rapidamente do que em meio sólido. Este é um fato que é conhecido há muitos anos.

A segunda é que, se observarmos esses meios líquidos ao microscópio, podemos detectar o crescimento de myb tuberculosis muito mais rapidamente do que esperar pelo aparecimento macroscópico de colônias em meios sólidos. E, de fato, esse crescimento é inteiramente característico, de modo que podemos distinguir M tuberculosis em meio líquido de contaminação por bactérias ou fungos, ou mesmo do crescimento de micobactérias não tuberculosas atípicas que podem estar presentes. Finalmente, e esta é talvez a coisa mais empolgante sobre o ensaio mods, é que podemos incorporar as drogas é rifampicina e, portanto, resistência a múltiplas drogas diretamente do escarro.

Ao usar esses medicamentos no início do ensaio, podemos detectar a tuberculose e, ao mesmo tempo, se o isolado é ou não resistente a esses dois medicamentos. E isso evita a necessidade de subcultura e criação de um teste indireto de suscetibilidade a drogas. Então, agora vamos apenas descrever o equipamento necessário para fazer o ensaio de mods.

É necessária uma geladeira para armazenar a mídia preparada. É necessária uma balança para pesar o is e a rifampicina. Um vórtice é necessário para a mistura do escarro.

Com a solução de descontaminação, a centrífuga é necessária para concentrar a amostra de escarro descontaminada, e esta deve ser capaz de atingir 3000 G. A centrífuga não precisa ser refrigerada, mas é absolutamente essencial que seja bios segura e seja bios segura. Para trabalhos micobacterianos que requerem que os baldes da centrífuga possam ser selados com tampas bloqueáveis. É necessária uma incubadora que possa atingir 37 e manter 37 graus centígrados.

Isso não precisa ser enriquecido com CO2. Um microscópio invertido é necessário para ler as placas mods, e este deve ter objetivos de quatro x e 10 x e autoclave é necessária para esterilizar o meio e também para descarte de cultura microbacteriana, micros de resíduos são necessários para alíquota em meios, um gabinete de segurança biológica. A classe dois é exigida para procedimentos que envolvem manipulação de amostras de escarro e inoculação de placas.

Os reagentes necessários para realizar o ensaio de mods são os seguintes, Middlebrook seven H nine media cascione e glicerol Panta, que é o suplemento antibiótico e OADC. Os estoques de suplementos nutricionais dos antibióticos são rifampicina dimetilsulfóxido, DMSO para preparação de rifampicina, hidróxido de sódio, citrato de sódio e cisteína de nil para descontaminação de escarro di, fosfato de sódio e fosfato monopotássico para preparação do tampão fosfato, hipoclorito de sódio a 10% para descarte de resíduos infectados e desinfetante para limpeza de superfícies de trabalho. Os seguintes plásticos e consumíveis também são necessários: tubos de vidro estéreis, filtros de 0,2 micrômetros para solventes aquosos e filtros de 0,2 micrômetros para solventes orgânicos, tubos de microcentrífuga, tubos de centrífuga de 15 mil, peppes sorológicos estéreis de 50 mililitros, 10 mililitros, peppes estéreis, pontas de micropipeta estéreis, placas de tipo de cultura de tecidos de 24 poços e sacos de ine do tipo Ziploc seláveis, são colocadas as placas de 24 poços após a amostra de escarro ser inoculada no meio.

Existem quatro grupos de soluções de estoque que podem ser preparadas com antecedência. A solução tampão fosfato é feita de uma combinação de soluções monobásicas de fosfato de sódio, diba e fosfato de potássio ajustadas a um pH de 6,8 mais ou menos 0,2. Esta solução é autoclavada a 121 a 124 graus centígrados por 15 minutos para esterilizar, e uma alíquota é cultivada em ágar nutriente para confirmar a esterilidade.

Isso pode ser armazenado na geladeira de dois a oito graus centígrados por até um mês. Cada amostra de escarro requer 10 mililitros de solução tampão de fosfato. A solução estoque para descontaminação do escarro é uma combinação de hidróxido de sódio citrato de sódio.

Essas soluções são combinadas em volumes iguais e autoclave a 121 a 124 graus centígrados por 15 minutos e também podem ser armazenadas na geladeira a dois a oito graus centígrados por até um mês. São necessários dois mililitros desta solução para cada amostra de escarro. O meio de cultura básico é composto por Middlebrook sete H nove com cascione e glicerol.

O pó de sete H nove é dissolvido em água destilada estéril contendo glicerol e cascione e misturado com agitação constante até se dissolver completamente. Este meio é autoclavado a 121 a 124 graus centígrados por 15 minutos e, após o resfriamento, é dividido em quats de 4,5 mililitros em tubos de vidro estéreis de 16 por 100 milímetros. O meio é incubado a 37 graus por 48 horas para verificar a esterilidade, que é indicada pela falta de turbidez após esse tempo e pode ser armazenado de dois a oito graus centígrados com a tampa bem fechada por até um mês.

Cada amostra de escarro requer um tubo contendo 4,5 mililitros dessa cultura. As soluções de estoque antibiótico médio são preparadas da seguinte forma, dissolvem-se completamente em água destilada estéril e filtradas com um filtro de seringa de 0,2 micrômetro para solventes aquosos. Alíquotas de 20 microlitros podem então ser armazenadas em tubos de microcentrifugação estéreis a menos 20 graus centígrados por até seis meses; cada alíquota de 20 microlitros é suficiente para até cem amostras.

As soluções estoque de rifampicina de oito miligramas por mil são preparadas dissolvendo a rifampicina em DMSO e água destilada estéril. Esta mistura é filtrada com um filtro de seringa de 0,2 micrômetro para solventes orgânicos e a solução pode ser armazenada em alíquotas de 20 microlitros em tubos de microcentrífuga estéreis a menos 20 graus centígrados por até seis meses, cada alíquota de 20 microlitros é suficiente para até 100 amostras. Então, agora chegamos à parte da metodologia em si e às três etapas que você precisa seguir no dia do procedimento.

Isso está convertendo as soluções de estoque em soluções de trabalho. Primeiro temos a solução de descontaminação, depois temos a solução de mídia. E, finalmente, as soluções de trabalho das drogas isen e Rifampicina.

O método de descontaminação, que é usado para a metodologia mods, é a metodologia padronizada de descontaminação de hidróxido de sódio. O nalk é um mucolítico, que ajuda a digerir o escarro e permite que o hidróxido de sódio faça a descontaminação. Para isso, precisamos de nossa solução estoque de citrato de sódio de hidróxido de sódio e 0,1 gramas de NA são adicionados a 20 ml dessa solução.

Qualquer solução que não seja usada no dia da preparação deve ser descartada. A preparação final do meio de cultura também deve ser feita apenas no dia do uso. Sete meios H nove armazenados são combinados com OADC e panta 4,5 mililitros do meio são combinados com 0,5 mililitros de OADC e 0,1 mililitros de Panta em cada tubo.

Isso é suficiente para uma amostra. As soluções de trabalho de cada medicamento são preparadas no dia do uso e quaisquer soluções que não sejam utilizadas devem ser descartadas porque a atividade não pode ser garantida alíquotas armazenadas são diluídas em 24. Placas de cultura de tecidos de poço serialmente com meio sete H nove oh A DC de modo que a concentração final do poço alcançada após a adição da amostra de escarro com meio seja de 0,4 microgramas por mil ácido fórico e um micrograma por mil para Rifampicina.

Agora, para o procedimento de descontaminação, dois mils de amostra de escarro são colocados em um tubo Falcon de base cônica e dois mils de nossa solução de descontaminação de leite de hidróxido de sódio são adicionados. A tampa é recolocada e firmemente aparafusada, após o que a suspensão é vórtice e deixada em repouso por 15 minutos, período durante o qual ocorre o procedimento de descontaminação. Após este tempo, 14 mililitros de solução tampão fosfato são adicionados.

A tampa é recolocada e aparafusada, e o tubo é colocado na centrífuga após 50 minutos a 3000 G, o sobrenadante S é decantado e o pellet que resta é a amostra que desejamos retirar usando os tubos de 5,1 mililitros de sete H nove panter OEDC. Nosso pellet é ressuspenso a um volume de aproximadamente dois mililitros. Metade dessa amostra ressuspensa é armazenada como backup em um tubo de microcentrífuga.

Isso está disponível caso nossa cultura seja contaminada e precisemos retirar a amostra novamente. O outro mililitro é adicionado aos sete H restantes nove oh um panter DC que está em nosso tubo de vidro, e esta é a nossa amostra que está pronta para ser revestida. 900 microlitros desta suspensão de meios e amostras são colocados em cada um dos quatro poços em uma coluna de uma placa de 24 poços.

Os poços restantes da placa de 24 poços são preenchidos com amostras subsequentes, de modo que cinco amostras preencham uma placa de 24 poços, uma para cada uma das cinco colunas, e a sexta coluna fica sem amostra. A sexta coluna serve como um controle negativo para esta coluna. Ele colocou todos os constituintes do meio sem uma amostra de escarro e claramente qualquer crescimento nesta coluna indica que temos um problema com contaminação cruzada e toda a placa precisa ser descartada.

Cada placa que executamos requer uma coluna de controle negativo. Então, agora temos nossa placa contendo todas as nossas amostras e mídias. Temos que adicionar nossas suspensões de antibióticos em uma placa separada.

Preparamos nossas diluições conforme descrito anteriormente de Rifampicina e Isid, e com um multi pet de quatro canais, coletamos 100 microlitros de cada um desses poços e dispensamos 100 microlitros de sete H nove OADC para cada um dos dois poços de controle e 100 microlitros de Rifampicina e 100 microlitros de isid para cada um dos dois poços contendo drogas. Assim que a placa estiver completa, a tampa é recolocada e colocada dentro. Um saco Ziploc a partir deste ponto não é aberto novamente e, portanto, qualquer cultura que cresça em meio líquido nunca terá a oportunidade de sair do saco.

Todas as leituras da placa a partir de agora são feitas dentro do saco, e o saco é colocado em um saco de autoclave e descartado no final da cultura. E desta forma, evitamos a manipulação de suspensões altamente concentradas de micobactérias. Vamos apenas dizer algumas palavras agora sobre controle de qualidade.

Existem controles de qualidade embutidos na metodologia mods, que são essenciais para o uso adequado do ensaio. Em primeiro lugar, existem controles negativos e estes são executados em cada placa. Estes foram mencionados anteriormente, mas em resumo, temos uma coluna que contém todos os constituintes do meio sem a presença de uma amostra de escarro ao lado de cinco outras amostras de escarro em uma placa, os poços na coluna devem ser examinados assim como quaisquer outros poços e a presença de qualquer crescimento nesses poços indica que a contaminação cruzada ocorreu e que nenhum dos resultados na placa pode, portanto, ser confiável.

A placa deve, portanto, ser descartada e todas as amostras devem ser replaqueadas. Além disso, existem controles internos que são controles positivos. Estes são executados em uma placa separada, e esta placa é preparada depois que todas as outras placas de amostra foram preparadas no final do dia para minimizar o risco de contaminação cruzada dentro do laboratório.

Nesta placa separada, executamos uma cepa totalmente suscetível de mycobacterium tuberculosis e uma cepa resistente ao ISID e à rifampicina. Se houver preocupações sobre a execução de uma cepa multirresistente em uma placa, uma cepa monorresistente à rifampicina pode ser executada sem uma cepa monorresistente no lugar dessas duas cepas suscetíveis e MDR. O objetivo dessas cepas é demonstrar não apenas que a mídia suporta o crescimento, portanto, todos os nossos controles positivos devem ter crescimento na riqueza livre de drogas, mas também que nossas concentrações de drogas estão corretas e, portanto, os controles positivos suscetíveis não devem crescer na presença de is e rifampicina e os controles positivos resistentes devem obviamente crescer através das concentrações de rifampicina e is que estão presentes na placa.

Ok, agora vamos para a leitura do prato. Se considerarmos o dia do revestimento de nossos amostradores, a leitura da placa do dia zero começa no quinto dia. Antes disso, o crescimento de micobactérias é muito raramente visto.

As placas são examinadas sob um microscópio de luz invertida. Ou seja, as placas são examinadas de baixo para cima, e isso nos permite ver os cordões com muita clareza, a tentativa de visualizar as culturas de cima é dificultada pela condensação na tampa das placas, e também porque a distância focal não é adequada de um microscópio padrão. O exame microscópico é geralmente realizado com as culturas 10 x objetivas positivas consideradas como aquelas em que há pelo menos duas unidades formadoras de colônias em ambos os poços livres de drogas.

A presença de contaminação é prontamente reconhecida porque o meio fica turvo e, no quinto dia, geralmente há crescimento excessivo da maior parte do poço. Em contraste, o crescimento micobacteriano não leva a uma nebulosidade do crescimento inicial das micobactérias formam pequenas formas semelhantes a vírgulas, que progridem constantemente para formar cordas ou emaranhados característicos. Dentro de duas semanas, um crescimento fortemente positivo terá formado conglomerados de micobactérias com cordões apenas visíveis nas extremidades.

A grande maioria das culturas que vão se tornar positivas são positivas no dia 14 e, portanto, recomendamos leituras diárias do dia cinco ao dia 14 e, posteriormente, leituras a cada dois ou três dias de acordo com a carga de trabalho do laboratório no dia em que uma cultura é claramente positiva nos dois poços livres de drogas, os poços contendo drogas devem ser lidos. Qualquer crescimento na presença de qualquer um dos medicamentos indica resistência a esse medicamento. É muito importante observar que, se a região dos poços contendo medicamentos for feita mais de uma semana após a observação de uma cultura positiva nos poços livres de medicamentos, isso pode não representar resistência, pois é observado um crescimento ocasional.

As leituras podem parar no dia 21 se uma cultura for negativa, pois culturas positivas após esse período nunca são encontradas em pacientes que não recebem terapia Após a conclusão de 21 dias de incubação, as culturas podem ser descartadas. As culturas permanecem dentro de seus sacos Ziploc e são colocadas em sacos de autoclave e autoclave a 121 a 124 graus centígrados por 45 a 60 minutos, após os quais podem ser descartadas com segurança. Vou apenas dizer algumas palavras agora sobre biossegurança e o ensaio de mods, pois estamos lançando mods não apenas no Peru, mas também em ambientes na África e na Ásia.

Surge uma questão recorrente sobre a segurança e a biossegurança do uso de culturas microbacterianas em meios líquidos. Este é um medo compreensível porque, obviamente, líquidos podem ser derramados e meios sólidos não apresentam esse risco, e também há risco de aerossolização quando estamos lidando com suspensões de micobactérias. Na verdade, é por essas mesmas razões que acreditamos que a metodologia mod é uma metodologia mais segura do que qualquer metodologia que exija testes indiretos de suscetibilidade a medicamentos.

A razão para isso é que, para testes de suscetibilidade indireta, é preparada uma suspensão de uma concentração conhecida de microbactérias. Isso, portanto, envolve a manipulação de soluções altamente concentradas de microbactérias com todos os riscos de derramamento e aerossolização. Em contraste, a metodologia mods, como você deve ter visto agora, envolve simplesmente a inoculação de uma amostra de escarro em nosso prato, após o que o prato é selado dentro de um saco plástico.

Esta bolsa nunca mais é aberta e, portanto, não temos que lidar com essas suspensões altamente concentradas. Isso não quer dizer que acreditamos que a metodologia mod seja completamente segura, o manuseio de micobactérias sempre traz um risco. No entanto, dados da Coréia publicados em 2006 pareciam ter justificado nossa posição de que mods não são mais perigosos do que qualquer outra cultura.

Este foi um estudo realizado em trabalhadores de laboratório, que mostrou que os riscos ocupacionais para os trabalhadores de laboratório que fizeram culturas e não tiveram responsabilidade pelo teste de sensibilidade aos medicamentos não foram maiores do que para aqueles que estão fazendo baciloscopia. Em contraste, aqueles que estão lidando com suspensões de micobactérias e fazendo testes de suscetibilidade a medicamentos têm taxas muito mais altas de risco ocupacional para tuberculose. Claramente, é de suma importância que todos os funcionários do laboratório de trabalho sejam protegidos o máximo possível e, portanto, recomendamos fortemente que nenhum desses procedimentos seja realizado sem proteção respiratória pessoal adequada, o que significa máscaras padrão N95.

Além disso, é necessário um gabinete ou exaustor de segurança biológica de classe dois, no qual todas as áreas exaustas sejam filtradas por filtros HEPA. Finalmente, um mecanismo simples que é muito importante para evitar a turbulência do fluxo de ar dentro de um laboratório é uma fechadura na porta do laboratório para impedir a entrada e saída de pessoal enquanto as amostras estão sendo processadas. Isso reduz o risco de transmissão dentro do laboratório, então espero que isso seja Dado a você uma, uma boa visão geral do que a metodologia mods envolve e quão útil ela pode ser em ambientes onde os recursos são limitados, mas diagnósticos de TB e MDR TB de alta qualidade são urgentemente necessários.

Para obter mais informações, você pode visitar nosso site, mods peru. org, onde você encontrará nossos procedimentos operacionais padrão detalhados, o guia do usuário para mods. Além dos POPs para o processamento de amostras extrapulmonares, também temos uma biblioteca de fotos de micobactérias e tuberculose, outras micobactérias e contaminação bacteriana e fúngica, e você também pode encontrar nossa estratégia de garantia de qualidade e o procedimento que recomendamos para credenciamento de laboratórios para começar a usar mods.

Por fim, há uma folha de perguntas frequentes e agradecemos qualquer feedback dos usuários que estão usando mods, pois essa é uma metodologia iterativa. Como explicamos anteriormente, é um teste não proprietário e estamos sempre interessados em melhorias que outros laboratórios conseguiram fazer.