Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

O vírus Vao é comumente usado como um vetor de DNA usado em combinação com linhagens de células de insetos para expressão de proteínas. No entanto, o fato de esse vírus infectar insetos com eficiência com consequências letais também o torna um agente inseticida eficaz. No Brasil, por exemplo, o vírus balo do tipo selvagem é aplicado anualmente em mais de 1 milhão de hectares de lavouras de soja para controle da lagarta do feijão para aumentar sua eficácia inseticida, os vírus Balo foram geneticamente modificados com genes que codificam toxinas específicas do inseto que são ativas dentro do HemosIL do inseto.

Neste vídeo, demonstramos métodos para infecção oral de larvas de lepidópteros com o vírus bacao, a fim de analisar a eficácia inseticida. Olá, sou do laboratório de desossa cega do Departamento de Oftalmologia e da Universidade Estadual de Iowa, e também sou Wendy Sparks, do laboratório de desossa. Hoje mostraremos dois procedimentos para infecção pelo vírus VA de lter e larvas.

Primeiro, Harran mostrará como infectar larvas de recém-nascidos usando um bioensaio de alimentação de gotículas. E então mostrarei como infectar larvas de ínstar médio a tardio usando um bioensaio de sangue dietético. Então vamos começar.

Os bioensaios de alimentação por gotículas podem ser usados para a determinação da dose letal de abacavir e sobrevivência. Tempo de larvas infectadas pelo vírus balo. Larvas de ínstar precoce ou recém-nascidos são geralmente usadas para este ensaio.

Antes de começar, certifique-se de ter copos dietéticos com a dieta apropriada à mão. Além disso, prepare as diluições de vírus apropriadas incluem corante alimentar verde a uma concentração de 4% em volume. Para determinar a concentração viral letal, a diluição deve dar uma faixa de mortalidade entre um a 99%Bioensaios preliminares podem ser necessários para determinar uma faixa apropriada de concentrações de vírus após o vórtice do tubo para evitar a sedimentação dos poliedros, fazer dois círculos concêntricos de pequenas gotículas da solução do vírus em uma placa de Petri de 60 milímetros.

Para cada concentração de vírus usada, lembre-se de configurar também uma infecção simulada de controle negativo. Em seguida, transfira 25 a 30 larvas de recém-nascidos para o meio dos círculos concêntricos usando um pincel estéril. Coloque a tampa no prato e sele com paraforme para evitar que as larvas escapem.

O ideal é usar pincéis diferentes para a transferência para cada tipo de vírus para evitar a contaminação entre os tratamentos. Deixe o prato repousar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, durante os quais as larvas bebem. As larvas da solução que se alimentaram podem ser identificadas pela coloração verde do intestino anterior resultante da transferência do corante alimentar verde apenas para as larvas que se alimentaram de copos plásticos de uma onça, que contêm dieta transfere uma larva por xícara.

Após a transferência das larvas, cubra os copos com tampas e incube a 28 graus Celsius 24 horas após a infecção. Elimine todos os copos que contenham larvas mortas. Essas mortes prematuras provavelmente resultam do manuseio de lesões.

Ao usar este bioensaio para determinar a dose letal, as larvas devem ser verificadas a cada dois ou três dias até que as larvas infectadas simuladas e quaisquer larvas tratadas com vírus sobreviventes tenham se purificado ou começado a se emprestar para pupar as larvas infectadas pelo vírus permanecerão no topo do alimento e morrerão após alguns dias. As larvas mortas às vezes se transformam em larvas pretas que morrem de infecção tornam-se essencialmente sacos de poliedros, que se dissolvem completamente. Se perturbado mecanicamente neste momento, pontue a mortalidade larval em cada tratamento.

Os bioensaios de concentração letal devem ser replicados três ou quatro vezes em ocasiões separadas. Use 30 indivíduos por dose para cada vírus ou tratamento de controle. Use um programa de análise de inventário apropriado, como polo ou SAS, para calcular os valores de lc 50, intervalos de confiança de 95% e as estatísticas apropriadas.

Este ensaio de alimentação de gotículas também pode ser usado para determinar os valores de tempo de sobrevivência ST 50. Nesse caso, a mortalidade das larvas é pontuada a cada quatro a oito horas com observações mais frequentes. Se a taxa de mortalidade for alta, o tempo de sobrevida é realizado, os bioensaios são realizados usando uma dose de lc 99 de tempo médio de sobrevivência do vírus, e os limites de confiança de 95% são calculados usando o estimador de Kaplan Mayer usando um programa s plus ou SAS.

Agora que Harang mostrou a você o bioensaio de alimentação por gotículas, mostrarei o bioensaio de plug de dieta no bioensaio de plug de dieta. As larvas de ínstar médio a tardio são alimentadas com um tampão de dieta tratado com uma dose conhecida de vírus para determinar a dose letal ou LD 50 no dia anterior à realização deste ensaio. Remova a dieta do copo para matar as larvas de fome durante a noite.

Esta etapa aumentará a velocidade com que as larvas consomem o vírus. Cubo de dieta inoculado no dia seguinte, prepare a dieta cortando-a em cubos pequenos de cerca de dois milímetros cúbicos. Se os cubos de dieta forem muito pequenos, eles secarão.

Se os cubos de dieta forem muito grandes, as larvas não poderão consumir todo o cubo de dieta durante a noite. Agora adicione um a dois microlitros de suspensão de poliedros a cada cubo de dieta. A suspensão contém 4% por volume de corante alimentar.

Deixe a suspensão absorver a dieta por cinco a 15 minutos. Lembre-se também de preparar um cubo de dieta simulado tratado com vírus como controle negativo. Em seguida, transfira um cubo de dieta para cada larva de quarto ínstar em cada xícara.

Em seguida, coloque os copos na incubadora durante a noite a 28 graus Celsius no dia seguinte, descarte todas as larvas que não comeram completamente o cubo de dieta. Em seguida, adicione um grande pedaço de dieta a cada xícara para as larvas restantes. Mantenha as larvas a 28 graus Celsius, adicionando dieta adicional conforme necessário até que as larvas infectadas simuladas e as larvas infectadas pelo vírus sobrevivente tenham se transformado ou comecem a se transformar.

Neste momento, registre o número de insetos mortos e sobreviventes. Mostraremos apenas dois métodos para infectar insetos com vírus nas costas, sangramento, biópsia de alimentação e biópsia de placa dietética. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que as larvas mortas pelo vírus vao dos cadáveres são tipicamente frágeis e podem facilmente se romper, liberando vírus.

Portanto, esterilize as superfícies de trabalho e descarte luvas contaminadas e materiais descartáveis de maneira adequada para evitar contaminação. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.