Name: Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-03T23:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda técnicas de infecção oral em lagartas de Lepidoptera com baculovirus para avaliar a eficácia inseticida. Os métodos incluem bioensaios de alimentação por gota e plugue de dieta.

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Visite <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Protocolos Springer</a> para saber mais sobre o baculovírus de engenharia como um agente insecidical e as técnicas de infecção oral utilizado neste ensaio.

Os autores não têm nada a declarar.

protocolos para a infecção oral de lagartas de lepidoptera com baculovirus

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculovírus são amplamente utilizados tanto como vetores de expressão de proteínas e como agentes de controle de insetos pragas. Este vídeo mostra como larvas de lepidópteros podem ser infectados com poliedros pela alimentação e dieta gota plug-bioensaios. Este acompanhamento Springer Protocolos seção fornece uma visão geral do ciclo de vida de baculovírus e uso de baculovírus como agentes inseticidas, incluindo a discussão dos prós e contras para o uso de baculovírus como inseticidas, e os progressos realizados no melhoramento genético de baculovírus para a eficácia inseticida melhorou.

Neste vídeo, demonstramos técnicas de infecção oral de larvas de lepidópteros com baculovírus, a fim de determinar a eficiência inseticida.

Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Os baculovírus são amplamente utilizados tanto como vetores de expressão proteica quanto como agentes de controle de pragas de insetos. Este vídeo mostra como larvas de lepidópteros podem ser ...

O vírus Vao é comumente usado como vetor de DNA em combinação com linhagens celulares de insetos para expressão proteica. No entanto, o fato de esse vírus infectar eficientemente insetos com consequências letais também o torna um agente inseticida eficaz. No Brasil, por exemplo, o vírus balo selvagem é aplicado em mais de 1 milhão de hectares de lavouras de soja anualmente para o controle da lagarta-da-soja, a fim de aumentar sua eficácia inseticida. Vírus Balo foram geneticamente modificados com genes que codificam toxinas específicas para insetos, as quais são ativas dentro do hemocela do inseto.Neste vídeo, demonstramos métodos para infecção oral de larvas de lepidópteros com o vírus bacao, a fim de analisar a eficácia inseticida. Olá, sou do laboratório Blind Boning do Departamento de Oftalmologia da Universidade Estadual de Iowa, e eu sou Wendy Sparks, também do laboratório Boning. Hoje vamos mostrar a você dois procedimentos para infecção de larvas de lter com o vírus VA.Primeiro, Harran mostrará como infectar larvas neonatas utilizando um bioensaio por alimentação em gota. Em seguida, eu mostrarei como infectar larvas de instar médio a tardio utilizando um bioensaio com dieta contendo sangue. Vamos começar.Ensaios biológicos de alimentação em gotas podem ser utilizados para determinar a dose letal de abacavir e a sobrevivência ao longo do tempo de larvas infectadas com o vírus balo. Larvas de estádios iniciais ou neonatas são geralmente usadas para este ensaio.Antes de começar, certifique-se de ter copos com a dieta apropriada prontos. Além disso, prepare as diluições virais apropriadas, incluindo corante verde para alimentação até uma concentração de 4% em volume. Para determinar a concentração viral letal, a diluição deve produzir uma faixa de mortalidade entre 1 e 99%. Ensaios preliminares de bioensaio podem ser necessários para determinar uma faixa apropriada de concentrações virais. Após vórtex no tubo para evitar a sedimentação dos poliedros, faça dois círculos concêntricos de pequenas gotas da solução viral em uma placa de Petri de 60 milímetros.Para cada concentração de vírus utilizada, lembre-se de preparar também uma infecção mock de controle negativo. Em seguida, transfira 25 a 30 larvas neonatas para o centro dos círculos concêntricos usando um pincel estéril. Coloque a tampa na placa e feche com parafilm para impedir que as larvas escapem.Idealmente, utilize pinceis diferentes para a transferência de cada tipo de vírus, a fim de evitar contaminação entre os tratamentos. Deixe a placa em repouso à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, período durante o qual as larvas ingerem o alimento. As larvas que se alimentaram podem ser identificadas pela coloração verde no intestino anterior, resultante do corante alimentar verde. Transfira apenas as larvas que se alimentaram para copos plásticos de uma onça, que contêm dieta, colocando uma larva por copo.Após transferir as larvas, cubra os copos com tampas e incube a 28 graus Celsius por 24 horas após a infecção. Descarte quaisquer copos contendo larvas mortas. Essas mortes precoces provavelmente resultam de lesões causadas pelo manejo.Ao utilizar este bioensaio para determinar a dose letal, as larvas devem ser verificadas a cada dois ou três dias até que as larvas controle não infectadas e quaisquer larvas tratadas com vírus que sobreviveram tenham se alimentado completamente ou começado a se enterrar para pupar; larvas infectadas pelo vírus permanecerão na superfície do alimento e morrerão após alguns dias. Larvas mortas às vezes encolhem e escurecem, e aquelas que morrem devido à infecção essencialmente se tornam bolsas de poliedros, que se dissolverão completamente. Se forem mecanicamente perturbadas neste momento, registre a mortalidade larval em cada tratamento.Os bioensaios de concentração letal devem ser replicados três ou quatro vezes em ocasiões distintas. Utilize 30 indivíduos por dose para cada tratamento com vírus ou controle. Utilize um programa apropriado de análise probit, como polo ou SAS, para calcular os valores de CL50, os intervalos de confiança de 95% e as estatísticas apropriadas.Este ensaio de alimentação por gotas também pode ser utilizado para determinar os valores de tempo de sobrevivência ST 50. Nesse caso, a mortalidade das larvas é avaliada a cada quatro a oito horas, com observações mais frequentes. Se a taxa de mortalidade for alta, os bioensaios de tempo de sobrevivência são realizados usando uma dose LC 99 do vírus; os tempos médios de sobrevivência e os limites de confiança de 95% são calculados utilizando o estimador de Kaplan-Meier com um programa S-Plus ou SAS.Agora que Harang lhe mostrou o bioensaio de alimentação por gota, vou mostrar o bioensaio com tampão de dieta. No bioensaio com tampão de dieta, larvas de instar médio a tardio são alimentadas com um tampão de dieta tratado com uma dose conhecida de vírus para determinar a dose letal ou DL50. No dia anterior à realização deste bioensaio, remova a dieta do copo para privar as larvas de alimento durante a noite.Esta etapa aumentará a velocidade com que as larvas consomem o vírus. No dia seguinte, inocular o cubo de dieta, preparar a dieta cortando-a em pequenos cubos de cerca de dois milímetros cúbicos. Se os cubos de dieta forem muito pequenos, eles secarão.Se os cubos de dieta forem muito grandes, as larvas não poderão consumir todo o cubo de dieta durante a noite. Adicione agora um a dois microlitros de suspensão de poliedros a cada cubo de dieta. A suspensão contém corante alimentar a 4% em volume.Deixe a suspensão penetrar na dieta por cinco a 15 minutos. Lembre-se de preparar também um cubo de dieta tratado com vírus simulado como controle negativo. Em seguida, transfira um cubo de dieta para cada larva do quarto estádio em cada copo.Em seguida, coloque os copos no incubador durante a noite a 28 graus Celsius. No dia seguinte, descarte as larvas que não tiverem consumido completamente o cubo de dieta. Em seguida, adicione um grande pedaço de dieta a cada copo para as larvas restantes. Mantenha as larvas a 28 graus Celsius, adicionando dieta adicional conforme necessário até que as larvas mock infectadas e as larvas infectadas com vírus que sobreviveram tenham se alimentado ou começado a pupar.Neste momento, registre os números de insetos mortos e sobreviventes. Mostraremos apenas dois métodos para infectar insetos com o vírus back, sangria, biópsia por alimentação e biópsia da placa dietética. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os cadáveres de larvas mortas pelo vírus são tipicamente frágeis e podem facilmente romper, liberando o vírus.Portanto, esterilize as superfícies de trabalho e descarte luvas contaminadas e materiais descartáveis de maneira apropriada para prevenir contaminação. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos duas técnicas microaplicador usados ​​para infectar de larvas de lepidópteros com baculovírus, a fim de determinar a eficiência inseticida.

Protocolos para microaplicador assistida infecção de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

O método descrito aqui utiliza a injecção directa de bactérias entomopatogênicos no hemocelo...

Criação e injeção de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; As larvas para avaliar a virulência bacteriana

Oral e intra infecção haemocolic de larvas de traça da...

O inseto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana

Este vídeo demonstra um método para estabelecer um modelo de infecção por Mycobacterium bovis nas larvas da mariposa-da-cera, Galleria mellonella. Uma cepa bioluminescente de Mycobacterium bovis BCG é injetada na hemolinfa da larva para estabelecer a infecção, e a bioluminescência é medida em intervalos predefinidos para estudar o progresso da infecção.

Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em larvas de insetos

A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.

Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.

Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Aprenda técnicas de infecção oral em lagartas de Lepidoptera com baculovirus para avaliar a eficácia inseticida. Os métodos incluem bioensaios de alimentação por gota e plugue de dieta.

Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

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