Protocolos para microaplicador assistida infecção de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Embora o vírus baccala específico para artrópodes seja usado como uma ferramenta de pesquisa padrão para sistemas de expressão de proteínas eucarióticas, ele também está sendo desenvolvido como um agente inseticida ambientalmente seguro, que pode matar insetos herbívoros como lepidópteros na natureza. As larvas de lepidópteros são infectadas pelo vírus baccala ao comer folhagem infectada. As larvas ou lagartas ingerem o vírus baccala em uma forma conhecida como poliedro, que é um complexo de partículas virais embaladas em uma grande estrutura de proteína cristalina que protege o vírus da dessecação.

Uma vez que a larva é infectada, o vírus da bunda dissemina a infecção dentro do inseto. O vírus sequestra o ácido nucléico e a maquinaria de síntese de proteínas do hospedeiro para produzir mais vírus e poliedros. Eventualmente, as larvas ficam tão completamente infectadas com o vírus que se dissolvem em um lodo confuso de poliedros que pinga nas superfícies das plantas comidas pelo inseto, e então o ciclo começa de novo para determinar a eficácia inseticida de um baca em particular.

As técnicas de microaplicador de cepas Avir e os bioensaios podem ser combinados. As larvas de Leid dorin podem ser infectadas por injeção de vírus de ponta diretamente no HemosIL ou na cavidade corporal e as taxas de mortalidade podem ser avaliadas. Além disso, as larvas podem ser infectadas com poliedros usando injeção assistida por microaplicador oral e o momento da infecção do intestino e de outros tecidos pode ser testado.

Olá, sou Wendy Sparks no laboratório de Brian e desossa no Departamento de Entomologia da Universidade Estadual de Iowa E também sou de desossar snap. Hoje mostraremos dois procedimentos para infectar o DI do duto de laboratório com o vírus backlog. Ambos os métodos usam micro aplicador.

Em primeiro lugar, mostrarei a você o uso de um microaplicador para entregar o vírus do corpo no he no heni através do prole. Então, quando mostrar que você usa o micro aplicador para entregar o cabeçalho poli na guarda intermediária através do mouse. Então vamos começar.

Quando desenvolvidos para fins inseticidas, os vírus balo geralmente contêm o gene poliedro para facilitar a infecção oral de larvas de pragas. No entanto, ocasionalmente, há razões para testar um vírus baccala poliedro negativo para possíveis efeitos inseticidas ou para contornar o intestino de um inseto. Nesse caso, a injeção de vírus de topo usando um microaplicador pode ser realizada para infectar as larvas antes de iniciar o ensaio.

O título do estoque de trabalho do vírus deve ser determinado usando ensaio de placa ou ensaios de diluição final. Para experimentos fisiológicos, injeções de cinco vezes 10 para o quarto PFU por quinto ínstar H VNS seriam típicas. Para iniciar este bioensaio, carregue cada diluição do vírus em uma seringa de plástico de um cc para hercule com uma ponta de agulha afiada de calibre 28,5 ou 32.

Geralmente um a três microlitros de solução de vírus de ponta. Com um título de 10 elevado ao sétimo, menos 10 elevado ao oitavo por mililitro pode ser usado para cada larva, de modo que carregar 300 a 500 microlitros na seringa seja suficiente para a maioria dos propósitos. Em seguida, retire as bolhas de ar da seringa segurando a seringa na vertical para levar o ar à ponta da agulha e dispense.

Em seguida, fixe a seringa no tubo de suporte da seringa. Agora defina o volume para 1,0 microlitro. Para cada gota na unidade de controle do microprocessador do microaplicador, calibre a unidade de controle primeiro para garantir que o volume correto seja dispensado, a velocidade com que a gota é dispensada pode ser definida em uma escala de zero a nove.

Um intervalo de zero a um é comumente usado. Pressione o pedal para garantir que a solução seja dispensada adequadamente. Lembre-se de que, se for dispensada muita solução ou se a aplicação for muito lenta, as configurações de volume e velocidade podem ser ajustadas até que o volume certo de solução seja aplicado na taxa correta.

Agora estou pronto para começar a injeção para infecção por H VNS. No início do quinto, as larvas de ínstar são normalmente injetadas, o tamanho maior dos instares posteriores facilita o processo de injeção. Insira a ponta da agulha através da plana de uma das pernas profissionais e na cavidade do corpo.

Observe que, quando a ponta da agulha se inserir no prole, mude a posição do corpo larval Para evitar danos ao intestino e à parede do corpo, agora pressione o pedal quatro vezes para fornecer quatro microlitros da solução do vírus no selo hemo. Após a conclusão das injeções, retorne todas as larvas para a incubadora de 28 graus Celsius. Verifique frequentemente se há larvas mortas e certifique-se de que uma dieta adequada esteja disponível para as larvas sobreviventes.

Embora os instares tardios não morram devido a lesões na cutícula resultantes da injeção, as larvas ainda devem ser verificadas 24 horas após a injeção em caso de danos ao intestino, que podem resultar de infecção bacteriana. Essa mortalidade precoce deve ser excluída da análise dos dados. Se estiver usando o bioensaio assistido por microaplicador com vírus de topo para bioensaios de concentração letal, o bioensaio deve ser replicado três ou quatro vezes em ocasiões separadas.

Use 30 indivíduos por dose para cada vírus ou tratamento de controle. Use um programa de análise de inventário apropriado, como polo ou SAS, para calcular os valores de lc 50, intervalos de confiança de 95% e as estatísticas apropriadas. Este bioensaio também pode ser usado para determinar os valores de tempo de sobrevivência do ST 50 após a inoculação de uma dose fixa de vírus.

Nesse caso, a mortalidade das larvas é pontuada a cada quatro a oito horas com observações mais frequentes. Se a taxa de mortalidade for alta, os tempos médios de sobrevida nos limites de confiança de 95% são calculados usando o estimador de Kaplan Meyer usando um programa s plus ou SAS. Agora que Harran mostrou a você o bioensaio assistido por microaplicador usando vírus de ponta.

Vou te mostrar o ensaio. Usando poliedros A inoculação oral de poliedros diretamente no intestino do inseto é usada quando o momento exato da infecção é crítico. Por exemplo, ao monitorar como o vírus se dissemina dentro do inseto para iniciar este ensaio, suspenda os poliedros em uma solução neutra de três a dois de glicerina e água de 10 a 300.

Os poliedros podem ser usados para a quarta instaração, por exemplo. Em seguida, coloque esta solução em uma seringa de tuberculina CC de plástico ou vidro com uma agulha de ponta romba de calibre 32. Coloque a seringa no tubo de suporte do microaplicador olhando para um microscópio.

Segure a quarta ou quinta larva estrela, insira a agulha pela boca e na região anterior do intestino médio e, em seguida, entregue o poliedro. Esta técnica requer alguma prática. Primeiro, pode ser complicado segurar as larvas com luvas sem esmagá-las.

Em segundo lugar, é preciso alguma prática para passar a agulha pelas partes da boca. Recomendamos que você pratique a inoculação de cerca de 30 larvas com PBS. Se acontecer de você perfurar o intestino, será óbvio porque as larvas derretem e ficam pretas rapidamente.

Novamente, como a inoculação oral assistida por microaplicador fornece o tempo exato da infecção, esse método é mais útil para experimentos nos quais o tempo de infecção é importante para determinar como o vírus se espalha dentro do inseto. Por exemplo, os vírus que expressam beta galactoses dase podem ser inoculados por via oral em larvas, que são então dissecadas em vários pontos de tempo para determinar quais tecidos são infectados quando Mostraremos apenas dois vasos assistidos por micro aplicador para infecção. Amor de inseto com vir, o primeiro dos quais foi a inoculação direta através do pro Legg do vírus de cabeça, e isso permite que você ignore a fisiologia intestinal e avalie a letalidade e o tempo letal do vírus em que você está interessado.

A segunda técnica foi a inoculação direta no intestino médio usando poliedros. Isso permite que você administre uma dose muito precisa diretamente no intestino médio, bem como controle o tempo muito preciso do evento. Então você pode estudar a mortalidade e outros fenótipos do vírus também.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que as larvas mortas pelo vírus baula de cadáveres são tipicamente frágeis e podem facilmente se romper, liberando vírus. Portanto, esterilize as superfícies de trabalho e descarte luvas contaminadas e materiais descartáveis de maneira adequada para evitar contaminação. Então é isso.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.