Name: Protocolos para microaplicador assistida infecção de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-23T13:32:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda técnicas de microaplicador para infectar larvas de lepidópteros com baculovirus por injeção direta ou inoculação oral. Estes métodos permitem avaliar a eficiência inseticida e estudar a disseminação viral em insetos.

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Visite <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Protocolos Springer</a> para saber mais sobre o baculovírus de engenharia como um agente insecidical e as técnicas microaplicador utilizado neste ensaio.

Os autores não têm nada a declarar.

protocolos para microaplicador assistida infecção de lagartas de lepidoptera com baculovirus

Protocols for Microapplicator-assisted Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculovírus são amplamente utilizados tanto como vetores de expressão de proteínas e como agentes de controle de insetos pragas. . Este vídeo mostra como larvas de lepidópteros podem ser infectados com técnicas microaplicador no intestino com poliedros de baculovírus e na hemolinfa com o vírus floresceu. Este acompanhamento Springer Protocolos seção fornece uma visão geral do ciclo de vida de baculovírus e uso de baculovírus como agentes inseticidas. Formulação e aplicação de baculovírus para fins de controle de pragas são descritos em outros lugares.

Neste vídeo, demonstramos duas técnicas microaplicador usados ​​para infectar de larvas de lepidópteros com baculovírus, a fim de determinar a eficiência inseticida.

Protocolos para microaplicador assistida infecção de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Os baculovírus são amplamente utilizados tanto como vetores de expressão proteica quanto como agentes de controle de pragas de insetos. Este vídeo mostra como larvas de lepidópteros podem ser...

Embora o vírus baculovírus, específico para artrópodes, seja utilizado como uma ferramenta-padrão em pesquisas para sistemas de expressão proteica em eucariotos, ele também está sendo desenvolvido como um agente inseticida ambientalmente seguro, capaz de eliminar insetos herbívoros, como os lepidópteros, na natureza. As larvas de lepidópteros são infectadas pelos baculovírus ao ingerir folhagem contaminada. As larvas ou lagartas ingerem o baculovírus numa forma conhecida como poliedro, que é um complexo de partículas virais embaladas numa grande estrutura proteica cristalina que protege o vírus contra a dessecação.Uma vez que a larva é infectada, o vírus dissemina a infecção dentro do inseto. O vírus se apropria da maquinaria de síntese de ácidos nucleicos e proteínas do hospedeiro para produzir mais vírus e poliedros. Eventualmente, a larva fica tão completamente infectada com o vírus que se dissolve em um exsudato viscoso de poliedros, que escorre sobre as superfícies das plantas ingeridas pelo inseto, reiniciando assim o ciclo, com o objetivo de determinar a eficácia inseticida de um determinado Baca.As técnicas de microaplicação de cepas víricas e bioensaios podem ser combinadas. Larvas de Leid dorin podem ser infectadas pela injeção do vírus diretamente no hemocele ou na cavidade corporal, e as taxas de mortalidade podem ser avaliadas. Além disso, as larvas podem ser infectadas com poliedros por meio de injeção assistida por microaplicador oral, e o momento da infecção do intestino e de outros tecidos pode ser analisado.Olá, sou Wendy Sparks no laboratório de Brian e boning do Departamento de Entomologia da Iowa State University e também sou da boning snap. Hoje mostraremos a você dois procedimentos para infectar Drosophila laboratorial com o vírus backlog. Ambos os métodos utilizam microaplicador.Primeiramente, vou mostrar como usar um microaplicador para administrar o vírus corporal no he no heni através do prole. Em seguida, mostrarei como usar o microaplicador para administrar poli cabeçote no mid guard através do mouse. Então, vamos começar.Quando desenvolvidos para fins inseticidas, os vírus balo geralmente contêm o gene da poliedrina para facilitar a infecção oral de larvas de pragas. No entanto, ocasionalmente, existem razões para testar um baculovírus negativo para poliedrina quanto aos seus possíveis efeitos inseticidas ou para contornar o intestino de um inseto. Nesse caso, pode-se realizar a injeção do vírus sem poliedrina utilizando um microaplicador para infectar as larvas antes de iniciar o ensaio.O título do estoque de trabalho do vírus butted deve ser determinado utilizando ensaio de placa ou ensaios de diluição em ponto final. Para experimentos fisiológicos, injeções de cinco vezes 10 à quarta PFU por quinto estágio H VNS seriam típicas. Para iniciar este bioensaio, carregue cada diluição do vírus butted em uma seringa plástica de um cc hercule com ponta de agulha fina de 28,5 ou 32 graus.Normalmente, um a três microlitros de solução do vírus butado, com uma titulação de 10 elevado a sete, menos 10 elevado a oito por mililitro, podem ser usados para cada larva, de modo que carregar 300 a 500 microlitros na seringa é suficiente para a maioria dos propósitos. Em seguida, elimine as bolhas de ar da seringa mantendo-a na posição vertical para trazer o ar até a ponta da agulha e então realize a dispensação.Em seguida, fixe a seringa no tubo de suporte da seringa. Agora, ajuste o volume para 1,0 microlitro. Para cada gota na unidade de controle do microaplicador, calibre primeiro a unidade de controle para garantir que o volume correto seja dispensado; a velocidade com que a gota é dispensada pode ser definida em uma escala de zero a nove.Uma faixa de zero a um é comumente utilizada. Pressione o interruptor de pedal para garantir que a solução seja dispensada adequadamente. Lembre-se de que, se for dispensada uma quantidade excessiva de solução ou se a aplicação for muito lenta, os ajustes de volume e velocidade podem ser modificados até que o volume adequado de solução seja aplicado à taxa correta.Estou agora pronto para iniciar a injeção para infecção por H VNS. Larvas do quinto estádio inicial são tipicamente injetadas, pois o tamanho maior dos estádios posteriores facilita o processo de injeção. Insira a ponta da agulha através da placa de uma das patas proleg e na cavidade corporal.Observe que, quando a ponta da agulha for inserida no prole, altere a posição do corpo da larva para evitar danos ao intestino e à parede corporal; agora, pressione o pedal quatro vezes para administrar quatro microlitros da solução viral no hemo selado. Após a conclusão das injeções, devolva todas as larvas ao incubador a 28 graus Celsius. Verifique com frequência a presença de larvas mortas e certifique-se de que a dieta adequada esteja disponível para as larvas sobreviventes.Embora os ínstares tardios não morram devido a lesões no tegumento resultantes da injeção, as larvas ainda devem ser examinadas 24 horas após a injeção, para verificar danos ao intestino, que poderiam resultar de infecção bacteriana. Essa mortalidade precoce deve ser excluída da análise dos dados. Se utilizar o bioensaio assistido por microaplicador com vírus aplicado por contato para bioensaios de concentração letal, o bioensaio deve ser replicado três ou quatro vezes em ocasiões separadas.Utilize 30 indivíduos por dose para cada tratamento com vírus ou controle. Utilize um programa apropriado de análise probit, como polo ou SAS, para calcular os valores de CL50, intervalos de confiança de 95% e as estatísticas apropriadas. Este bioensaio também pode ser usado para determinar os valores de tempo de sobrevivência ST50 após a inoculação de uma dose fixa de vírus.Neste caso, a mortalidade das larvas é avaliada a cada quatro a oito horas, com observações mais frequentes. Se a taxa de mortalidade for alta, os tempos médios de sobrevivência nos limites de confiança de 95% são calculados utilizando o estimador de Kaplan-Meier, com um programa S-Plus ou SAS. Agora que Harran lhe mostrou o bioensaio assistido por microaplicador utilizando o vírus butted.Vou mostrar a você o ensaio. A inoculação oral de poliedros diretamente no intestino do inseto é utilizada quando o momento exato da infecção é crítico. Por exemplo, ao monitorar como o vírus se dissemina dentro do inseto, para iniciar este ensaio, suspenda os poliedros em uma solução neutra e flutuante de três para dois de glicerina e água, de 10 a 300.Os poliedros podem ser usados para a quarta ínstar h ance, por exemplo. Em seguida, carregue esta solução em uma seringa plástica ou de vidro de um CC para tuberculina com uma agulha romba de 32 graus. Coloque a seringa no tubo de suporte do microaplicador olhando por um microscópio.Segure a larva estrela de quarto ou quinto estágio, insira a agulha pela boca e na região anterior do intestino médio, em seguida aplique os poliedros. Esta técnica exige alguma prática. Primeiramente, pode ser difícil segurar as larvas com luvas sem esmagá-las.Segundo, é necessário alguma prática para guiar a agulha além das peças bucais. Recomendamos que você pratique a inoculação de cerca de 30 larvas com PBS. Caso você acidentalmente perfure o intestino, será evidente, pois as larvas melanizarão e ficarão pretas rapidamente.Novamente, como a inoculação oral assistida por microaplicador fornece o momento exato da infecção, este método é mais útil para experimentos nos quais o tempo de infecção é importante para determinar como o vírus se espalha dentro do inseto. Por exemplo, vírus que expressam beta-galactosidase podem ser inoculados oralmente em larvas, que são então dissecadas em diferentes pontos temporais para determinar quais tecidos ficam infectados e quando. Mostraremos apenas dois vasos infectados com auxílio de microaplicador. Insetos infectados com vírus, o primeiro dos quais foi a inoculação direta via proleg do vírus em gotas, o que permite contornar a fisiologia do intestino e avaliar a letalidade e o tempo letal do vírus de interesse.A segunda técnica foi a inoculação direta no intestino médio utilizando poliedros. Isso permite entregar uma dose muito precisa diretamente no intestino médio, bem como controlar o momento exato do evento. Em seguida, você também pode estudar a mortalidade e outros fenótipos do vírus.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as larvas mortas por vírus cadáveres são geralmente frágeis e podem facilmente romper, liberando o vírus. Portanto, esterilize as superfícies de trabalho e descarte luvas contaminadas e materiais descartáveis de maneira apropriada para prevenir contaminação. É isso aí.Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos técnicas de infecção oral de larvas de lepidópteros com baculovírus, a fim de determinar a eficiência inseticida.

Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

O método descrito aqui utiliza a injecção directa de bactérias entomopatogênicos no hemocelo...

Criação e injeção de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; As larvas para avaliar a virulência bacteriana

Este vídeo demonstra um método para estabelecer um modelo de infecção por Mycobacterium bovis nas larvas da mariposa-da-cera, Galleria mellonella. Uma cepa bioluminescente de Mycobacterium bovis BCG é injetada na hemolinfa da larva para estabelecer a infecção, e a bioluminescência é medida em intervalos predefinidos para estudar o progresso da infecção.

Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em larvas de insetos

Este vídeo mostra a medição da carga bacteriana in vivo usando Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larvas de insetos infectados com lux. O processo envolve homogeneização larval, tratamento com substrato de luciferase e medição de bioluminescência para determinar unidades de luz relativas que se correlacionam com a carga bacteriana.

Medição da carga in vivo de bactérias que expressam luciferase em uma larva de inseto

A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.

Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.

Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Aprenda técnicas de microaplicador para infectar larvas de lepidópteros com baculovirus por injeção direta ou inoculação oral. Estes métodos permitem avaliar a eficiência inseticida e estudar a disseminação viral em insetos.

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