Protocolos para microaplicador assistida infecção de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Embora o vírus baculovírus, específico para artrópodes, seja utilizado como uma ferramenta-padrão em pesquisas para sistemas de expressão proteica em eucariotos, ele também está sendo desenvolvido como um agente inseticida ambientalmente seguro, capaz de eliminar insetos herbívoros, como os lepidópteros, na natureza. As larvas de lepidópteros são infectadas pelos baculovírus ao ingerir folhagem contaminada. As larvas ou lagartas ingerem o baculovírus numa forma conhecida como poliedro, que é um complexo de partículas virais embaladas numa grande estrutura proteica cristalina que protege o vírus contra a dessecação.

Uma vez que a larva é infectada, o vírus dissemina a infecção dentro do inseto. O vírus se apropria da maquinaria de síntese de ácidos nucleicos e proteínas do hospedeiro para produzir mais vírus e poliedros. Eventualmente, a larva fica tão completamente infectada com o vírus que se dissolve em um exsudato viscoso de poliedros, que escorre sobre as superfícies das plantas ingeridas pelo inseto, reiniciando assim o ciclo, com o objetivo de determinar a eficácia inseticida de um determinado Baca.

As técnicas de microaplicação de cepas víricas e bioensaios podem ser combinadas. Larvas de Leid dorin podem ser infectadas pela injeção do vírus diretamente no hemocele ou na cavidade corporal, e as taxas de mortalidade podem ser avaliadas. Além disso, as larvas podem ser infectadas com poliedros por meio de injeção assistida por microaplicador oral, e o momento da infecção do intestino e de outros tecidos pode ser analisado.

Olá, sou Wendy Sparks no laboratório de Brian e boning do Departamento de Entomologia da Iowa State University e também sou da boning snap. Hoje mostraremos a você dois procedimentos para infectar Drosophila laboratorial com o vírus backlog. Ambos os métodos utilizam microaplicador.

Primeiramente, vou mostrar como usar um microaplicador para administrar o vírus corporal no he no heni através do prole. Em seguida, mostrarei como usar o microaplicador para administrar poli cabeçote no mid guard através do mouse. Então, vamos começar.

Quando desenvolvidos para fins inseticidas, os vírus balo geralmente contêm o gene da poliedrina para facilitar a infecção oral de larvas de pragas. No entanto, ocasionalmente, existem razões para testar um baculovírus negativo para poliedrina quanto aos seus possíveis efeitos inseticidas ou para contornar o intestino de um inseto. Nesse caso, pode-se realizar a injeção do vírus sem poliedrina utilizando um microaplicador para infectar as larvas antes de iniciar o ensaio.

O título do estoque de trabalho do vírus butted deve ser determinado utilizando ensaio de placa ou ensaios de diluição em ponto final. Para experimentos fisiológicos, injeções de cinco vezes 10 à quarta PFU por quinto estágio H VNS seriam típicas. Para iniciar este bioensaio, carregue cada diluição do vírus butted em uma seringa plástica de um cc hercule com ponta de agulha fina de 28,5 ou 32 graus.

Normalmente, um a três microlitros de solução do vírus butado, com uma titulação de 10 elevado a sete, menos 10 elevado a oito por mililitro, podem ser usados para cada larva, de modo que carregar 300 a 500 microlitros na seringa é suficiente para a maioria dos propósitos. Em seguida, elimine as bolhas de ar da seringa mantendo-a na posição vertical para trazer o ar até a ponta da agulha e então realize a dispensação.

Em seguida, fixe a seringa no tubo de suporte da seringa. Agora, ajuste o volume para 1,0 microlitro. Para cada gota na unidade de controle do microaplicador, calibre primeiro a unidade de controle para garantir que o volume correto seja dispensado; a velocidade com que a gota é dispensada pode ser definida em uma escala de zero a nove.

Uma faixa de zero a um é comumente utilizada. Pressione o interruptor de pedal para garantir que a solução seja dispensada adequadamente. Lembre-se de que, se for dispensada uma quantidade excessiva de solução ou se a aplicação for muito lenta, os ajustes de volume e velocidade podem ser modificados até que o volume adequado de solução seja aplicado à taxa correta.

Estou agora pronto para iniciar a injeção para infecção por H VNS. Larvas do quinto estádio inicial são tipicamente injetadas, pois o tamanho maior dos estádios posteriores facilita o processo de injeção. Insira a ponta da agulha através da placa de uma das patas proleg e na cavidade corporal.

Observe que, quando a ponta da agulha for inserida no prole, altere a posição do corpo da larva para evitar danos ao intestino e à parede corporal; agora, pressione o pedal quatro vezes para administrar quatro microlitros da solução viral no hemo selado. Após a conclusão das injeções, devolva todas as larvas ao incubador a 28 graus Celsius. Verifique com frequência a presença de larvas mortas e certifique-se de que a dieta adequada esteja disponível para as larvas sobreviventes.

Embora os ínstares tardios não morram devido a lesões no tegumento resultantes da injeção, as larvas ainda devem ser examinadas 24 horas após a injeção, para verificar danos ao intestino, que poderiam resultar de infecção bacteriana. Essa mortalidade precoce deve ser excluída da análise dos dados. Se utilizar o bioensaio assistido por microaplicador com vírus aplicado por contato para bioensaios de concentração letal, o bioensaio deve ser replicado três ou quatro vezes em ocasiões separadas.

Utilize 30 indivíduos por dose para cada tratamento com vírus ou controle. Utilize um programa apropriado de análise probit, como polo ou SAS, para calcular os valores de CL50, intervalos de confiança de 95% e as estatísticas apropriadas. Este bioensaio também pode ser usado para determinar os valores de tempo de sobrevivência ST50 após a inoculação de uma dose fixa de vírus.

Neste caso, a mortalidade das larvas é avaliada a cada quatro a oito horas, com observações mais frequentes. Se a taxa de mortalidade for alta, os tempos médios de sobrevivência nos limites de confiança de 95% são calculados utilizando o estimador de Kaplan-Meier, com um programa S-Plus ou SAS. Agora que Harran lhe mostrou o bioensaio assistido por microaplicador utilizando o vírus butted.

Vou mostrar a você o ensaio. A inoculação oral de poliedros diretamente no intestino do inseto é utilizada quando o momento exato da infecção é crítico. Por exemplo, ao monitorar como o vírus se dissemina dentro do inseto, para iniciar este ensaio, suspenda os poliedros em uma solução neutra e flutuante de três para dois de glicerina e água, de 10 a 300.

Os poliedros podem ser usados para a quarta ínstar h ance, por exemplo. Em seguida, carregue esta solução em uma seringa plástica ou de vidro de um CC para tuberculina com uma agulha romba de 32 graus. Coloque a seringa no tubo de suporte do microaplicador olhando por um microscópio.

Segure a larva estrela de quarto ou quinto estágio, insira a agulha pela boca e na região anterior do intestino médio, em seguida aplique os poliedros. Esta técnica exige alguma prática. Primeiramente, pode ser difícil segurar as larvas com luvas sem esmagá-las.

Segundo, é necessário alguma prática para guiar a agulha além das peças bucais. Recomendamos que você pratique a inoculação de cerca de 30 larvas com PBS. Caso você acidentalmente perfure o intestino, será evidente, pois as larvas melanizarão e ficarão pretas rapidamente.

Novamente, como a inoculação oral assistida por microaplicador fornece o momento exato da infecção, este método é mais útil para experimentos nos quais o tempo de infecção é importante para determinar como o vírus se espalha dentro do inseto. Por exemplo, vírus que expressam beta-galactosidase podem ser inoculados oralmente em larvas, que são então dissecadas em diferentes pontos temporais para determinar quais tecidos ficam infectados e quando. Mostraremos apenas dois vasos infectados com auxílio de microaplicador. Insetos infectados com vírus, o primeiro dos quais foi a inoculação direta via proleg do vírus em gotas, o que permite contornar a fisiologia do intestino e avaliar a letalidade e o tempo letal do vírus de interesse.

A segunda técnica foi a inoculação direta no intestino médio utilizando poliedros. Isso permite entregar uma dose muito precisa diretamente no intestino médio, bem como controlar o momento exato do evento. Em seguida, você também pode estudar a mortalidade e outros fenótipos do vírus.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as larvas mortas por vírus cadáveres são geralmente frágeis e podem facilmente romper, liberando o vírus. Portanto, esterilize as superfícies de trabalho e descarte luvas contaminadas e materiais descartáveis de maneira apropriada para prevenir contaminação. É isso aí.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.