Não-específicas da Sigma ensaio de atividade de protease - A caseína como substrato

As proteases quebram ligações peptídicas no laboratório. Muitas vezes é necessário medir ou comparar a atividade de proteases da Sigma. O ensaio universal de atividade de protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases, o que fazemos durante nossos procedimentos de controle de qualidade.

Neste ensaio, a casiana atua como substrato quando a protease que estamos testando digere a casiana. O aminoácido tirosina é liberado juntamente com outros aminoácidos e fragmentos peptídicos. A tirosina livre reage então com o fenol da reagente de Folin-Ciocalteu ou reagente de Folin para produzir um cromóforo de cor azul, que é quantificável e medido como um valor de absorbância no espectrofotômetro.

Quanto mais tirosina for liberada da casaina, mais cromóforos serão gerados e maior será a atividade da protease. Os valores de absorbância gerados pela atividade da protease são comparados a uma curva padrão, que é obtida pela reação de quantidades conhecidas de tirosina com o reagente FC, a fim de correlacionar as alterações na absorbância. A partir da quantidade de tirosina em mícromols obtida pela curva padrão, a atividade das amostras de protease pode ser determinada em unidades, ou seja, a quantidade de mícromols de equivalência de tirosina liberada da casaina por minuto. Olá, meu nome é Carrie Cup Vineyard e sou cientista na nossa instalação Sigma Aldridge DeKalb aqui em St. Louis, Missouri.

Hoje, vou mostrar a vocês um método universalmente aplicável para testar a atividade de protease na Sigma Aldridge. Utilizamos principalmente este ensaio em nossa área de controle de qualidade para garantir que nossa protease tenha atividade suficiente antes de enviá-la diretamente para vocês em seu laboratório. Antes de iniciar o ensaio, precisamos garantir que os seguintes reagentes estejam corretamente preparados.

Um tampão de fosfato de potássio 50 milimolar, pH 7,5. A solução é colocada a 37 graus Celsius antes do uso. Uma solução de kasian 0,65% peso por volume, preparada pela mistura de 6,5 miligramas por mililitro em um litro. A temperatura da solução é aumentada gradualmente, com agitação suave, para 80 a 85 graus Celsius durante cerca de 10 minutos, até que uma dispersão homogênea seja obtida.

É muito importante não ferver a solução. Em seguida, o pH é ajustado, se necessário, com hidróxido de sódio e ácido clorídrico. Uma solução de ácido tricloroacético 110 milimolar é preparada diluindo-se um estoque 6,1 normal na proporção de 1 para 55 com água purificada 0,5 milimolar, cloretos de cálcio ou reagente fenólico, que é a solução que reagirá com a tirosina para gerar uma mudança de cor mensurável.

Isso estará diretamente relacionado à atividade das proteases. Uma solução de carbonato de sódio 500 milimolar preparada com 53 miligramas por mililitro de carbonato de sódio anidro em água purificada, uma solução diluente de enzima, que consiste em tampão de acetato de sódio 10 milimolar com cálcio 5 milimolar pH 7,5 a 37 graus Celsius. Essa solução é a que utilizamos para dissolver amostras sólidas de protease ou diluir soluções enzimáticas.

A solução estoque padrão de L-tirosina, que deve ter uma concentração inicial de 1,1 milimolar, uma solução de 0,2 miligrama por mililitro de L-tirosina, é preparada em água purificada e aquecida suavemente até que a tirosina se dissolva. Da mesma forma que com a casiana, não aqueça esta solução até a fervura. Deixe o padrão de L-tirosina esfriar até a temperatura ambiente.

Essa solução será diluída adicionalmente para preparar nossa curva padrão, se necessário, utilizando uma amostra sólida de protease com atividade previamente determinada, a qual é dissolvida com diluente enzimático até 0,1 a 0,2 unidades por mililitro. Essa solução serve como controle positivo no ensaio de controle de qualidade e como validação para os cálculos que realizaremos para determinar a atividade enzimática. Agora que preparamos nossos reagentes e todos estão na temperatura correta, iniciaremos nosso ensaio de protease.

Para iniciar este ensaio, encontre frascos apropriados que comportem cerca de 15 mililitros. Para cada enzima que você for testar, serão necessários quatro frascos. Um frasco será usado como branco, e outros três serão utilizados para avaliar a atividade de três amostras.

A diluição da protease em três diluições é útil ao verificar nossos cálculos finais um contra o outro, distribuindo cada conjunto de quatro frascos com cinco mililitros da nossa solução de 0,65% de kasian e deixando-os equilibrar em banho-maria a 37 graus Celsius por cerca de cinco minutos. Em seguida, adicione concentrações variadas da nossa solução de enzima a três dos frascos da amostra-teste, mas não ao branco. Misture-os girando suavemente e incube a 37 graus Celsius por exatamente 10 minutos.

A atividade da protease e a liberação consequente de tirosina durante este período de incubação serão medidas e comparadas entre nossas amostras de teste. Após esta incubação de 10 minutos, adicione cinco mililitros do reagente TCA a cada tubo. Em seguida, um volume apropriado de solução enzimática é adicionado a cada tubo, inclusive ao branco, de modo que o volume final da solução enzimática em cada tubo seja de um mililitro.

Isso é feito para levar em conta o valor de absorbância da própria enzima. Agora, incube as soluções a 30 graus Celsius por 30 minutos. Durante essa incubação de 30 minutos, você pode preparar as diluições do padrão de tirosina, o que é feito utilizando seis frascos DR.

Isso pode facilmente acomodar oito mililitros nos seis frascos. A solução estoque padrão de tirosina 1,1 milimolar é adicionada com os seguintes volumes em mililitros: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 e 0,5. Não adicione nenhum padrão de tirosina ao branco.

Pode ser necessário usar padrões mais baixos para amostras de teste da IPU que apresentarão pouca mudança de cor. Após a adição da solução padrão de tirosina, adicione um volume apropriado de água purificada a cada um dos padrões para completar o volume até dois mililitros. Após a incubação, filtre cada uma das soluções de teste e a amostra em branco.

Usando um filtro de seringa de 0,45 mícron, dois mililitros das amostras de teste e do filtrado em branco são então adicionados a quatro frascos DR que podem conter pelo menos oito mililitros. Você pode usar o mesmo tipo de frasco no qual os padrões foram preparados; a todos os frascos contendo os padrões e o branco padrão, adiciona-se cinco mililitros de carbonato de sódio e, para melhores resultados, o reagente recém-adicionado é adicionado imediatamente em seguida; o carbonato de sódio é então adicionado às nossas amostras de teste e ao branco de teste. Você observará que essas soluções ficam turvas após a adição do carbonato de sódio.

Em seguida, adiciona-se o reagente ninfaleno, que reagirá com a tirosina livre. Os frascos DRAM são então misturados por agitação suave e incubados a 37 graus Celsius por 30 minutos após essa incubação. Você deverá observar que os padrões apresentam uma graduação de cor que se correlaciona com a quantidade de tirosina adicionada, sendo as concentrações mais altas de tirosina as que aparecem mais escuras.

Você também pode observar uma mudança de cor acentuada em nossas amostras de teste. Dois mililitros dessas soluções são filtrados usando um filtro de seringa de 0,45 mícrons e cubetas apropriadas. Agora que concluímos nosso ensaio, vamos prosseguir para o espectrofotômetro e registrar nossos valores de absorbância.

A absorbância das nossas amostras é medida por um espectrofotômetro utilizando um comprimento de onda de 660 nanômetros. O caminho óptico é ajustado para um centímetro; registram-se os valores de absorbância para o branco padrão, os diferentes padrões, as amostras de teste e o branco de teste. Após a coleta de todos os dados, estamos prontos para criar a nossa curva padrão.

Para gerar a curva, é necessário calcular a diferença de absorbância entre o padrão e a amostra em branco do padrão. Esse valor de absorbância corresponde à quantidade de tirosina nas soluções padrão. Após esse cálculo simples, criamos nossa curva padrão plotando a variação da absorbância dos nossos padrões no eixo Y versus a quantidade em micromoles para cada um dos cinco padrões no eixo X.

Uma vez que tenhamos inserido nossos pontos de dados e gerado uma linha de melhor ajuste, determinamos a variação na absorbância das nossas amostras-teste calculando a diferença entre a absorbância da amostra-teste e a absorbância do branco-teste. Observando a nossa curva padrão, identificamos o valor de absorbância de uma das nossas amostras-teste no eixo Y. Em seguida, traçamos uma linha paralela ao eixo X até o ponto em que interceptamos a curva padrão.

Então, a partir da coordenada X obtida neste ponto, temos a quantidade em micromols de tirosina liberada durante esta reação proteolítica específica. Para obter a atividade da enzima em unidades por mililitro, realize o seguinte cálculo: tome o número de micromols de equivalentes de tirosina liberados, obtido a partir da curva padrão, e multiplique-o pelo volume total do ensaio em mililitros, que no nosso caso é 11 mililitros. Em seguida, divida este valor por outras três quantidades.

O tempo do ensaio, que realizamos por 10 minutos, o volume de enzima utilizado no ensaio, que foi variado. Vamos usar um mililitro. O volume de mililitros utilizado na detecção clorométrica, que pode diferir com base no seu Q vet.

Utilizamos dois mililitros. Micromols de tirosina divididos pelo tempo em minutos nos fornecem a nossa medida de atividade proteolítica, que denominamos unidades. Podemos cancelar as unidades de medida de volume no numerador e no denominador e, portanto, restará uma medida de atividade enzimática em termos de unidades por mililitro.

Para determinar a atividade em uma amostra sólida de protease diluída em diluente enzimático, dividimos nossa atividade em unidades por mililitro pela concentração do sólido utilizado originalmente neste ensaio em miligrama por mililitro, obtendo assim a atividade em unidades por miligrama. Acabamos de mostrar como analisar a atividade de protease utilizando o ensaio universal de atividade de protease da Sigma. Como você pôde observar ao realizar este procedimento, é fundamental lembrar-se de aquecer lentamente tanto as soluções de caseína quanto de tirosina, sem levá-las à ebulição.

Além disso, é essencial preparar brancos diferentes tanto para os seus padrões quanto para cada amostra-teste que você tiver. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com suas atividades de protease.