Name: Não-específicas da Sigma ensaio de atividade de protease - A caseína como substrato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a medir atividade de protease em bioquímica usando caseína como substrato. Este ensaio colorimétrico quantifica tirosina liberada para controle de qualidade em laboratórios.

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Antes de iniciar o ensaio, precisamos ter certeza de que os seguintes reagentes são corretamente preparado: <ol><li> Um tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7.5. Prepare com 11,4 mg / ml de fosfato de potássio dibásico, tri-hidratado em água purificada e ajustar o pH com HCl 1M. Esta solução é colocada a 37 ° C antes do uso. </li><li> Uma solução de caseína de 0,65% peso / volume, preparada pela mistura de 6,5 mg / ml de caseína no tampão fosfato 50 mM de potássio. Aumentou gradualmente a temperatura da solução, com agitação suave para 80-85 ° C por aproximadamente 10 minutos até que uma dispersão homogênea é alcançado. É muito importante não ferver a solução. O pH é ajustado se necessário, com NaOH e HCl. </li><li> A 110 mM Solução de ácido tricloroacético, preparada diluindo-se um estoque 6.1N 1:55 com água purificada. Ácido tricloroacético é um ácido forte e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> 0,5 mM Folin &amp; Ciolcaltea, ou reagente fenol Folin, que é a solução que irá reagir com a tirosina para gerar uma mudança de cor mensuráveis ​​que estará diretamente relacionada à atividade de proteases. Reagente Fenol Folin é um ácido e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> A 500 mM solução de carbonato de sódio é preparada com 53 mg / ml de carbonato de sódio anyhydrous em água purificada. Uma solução diluente enzima, que consiste em 10 mM tampão acetato de sódio com acetato de cálcio 5mM, pH 7,5, a 37 ° C. Esta solução é o que usamos para dissolver amostras protease sólido ou soluções diluídas da enzima. </li><li> 1,1 mM L-tirosina solução estoque padrão. Preparados com 0,2 mg / ml L-tirosina em água purificada e aquecida suavemente até a tirosina se dissolve. Tal como acontece com a caseína, não ferver esta solução. Permitir que o padrão L-tirosina para esfriar a temperatura ambiente. Esta solução será diluída mais para tornar a nossa curva padrão. </li><li> Solução de protease. Imediatamente antes de usar, dissolver em solução diluente protease enzima preparada no passo 6. </li></ol> Se necessário, use uma amostra sólida protease de atividade pré-determinada, que é dissolvido utilizando diluente enzima para 0,1-0,2 unidades / ml. Esta solução serve como um controle positivo para o ensaio controle de qualidade e como validação para os cálculos vamos realizar para determinar a atividade da enzima. Configurando o Ensaio Protease e Curvas Padrão <ol><li> Para começar este ensaio, encontrar frascos adequados que irá realizar cerca de 15 mls. Para cada enzima que será testado, 4 frascos são necessários. Um frasco será usado como um espaço em branco, e outros três serão utilizados para a atividade de ensaio de três diluições da protease. Três diluições são úteis ao verificar cálculos finais uns contra os outros. <ol><li> Para cada conjunto de quatro frascos, adicione 5mls da nossa solução de caseína de 0,65%. Deixe que eles se equilibram em banho-maria a 37 ° C por aproximadamente 5 minutos. </li><li> Adicionar variados volumes de solução de enzima que será testado para três dos frascos de amostra de teste, mas não o branco. Mix agitando e incubar por 37 ° C por exatamente 10 minutos. A atividade de protease e libertação conseqüentes de tirosina durante este tempo de incubação é o que vai ser medido e comparado entre as amostras de teste. </li></ol></li><li> Após esta incubação 10 minutos, adicione o 5 mls do reagente TCA a cada tubo para parar a reação. Em seguida, adicione um volume adequado de solução de enzima a cada tubo, mesmo em branco, para que o volume final da solução de enzima em cada tubo é de 1 ml. Isto é feito para dar conta do valor da absorbância da enzima em si e para garantir que o volume final em cada tubo é igual. Incubar as soluções a 37 ° C por 30 minutos. Durante esta incubação de 30 minutos, você pode querer configurar seu tirosina diluições padrão. Use dram 6 frascos (frascos dram pode ser substituído por tubos de polipropileno) que pode facilmente prender 8 mls. Aos seis frascos, adicione a 1,1 mM tirosina soluções estoque padrão com os seguintes volumes em mls: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Não adicione qualquer padrão de tirosina para o branco. Padrões mais baixos pode ser necessária para amostras impuras que trará mudança de cor pouco. Uma vez que a solução padrão de tirosina foi adicionado, adicione um volume adequado de água purificada a cada um dos padrões para obter um volume de 2 mls. </li><li> Após a incubação de 30 minutos, filtrar cada uma das soluções de teste e os em branco usando uma seringa de 0,45 polietersulfona filtro. Filtração é necessária para remover qualquer insolúveis das amostras. <ol><li> Adicionar a filtração 2 mls das amostras teste e filtrado em branco para 4 frascos dram que pode conter pelo menos 8 mls. O mesmo tipo de frasco nas quais as normas foram elaboradas podem ser usados. </li><li> A todos os frascos contendo as normas e padrão em branco, adicione 5mls de carbonato de sódio. Para melhores resultados, adicionar 1 ml de reagente de Folin imediatamente depois. </li><li> Adicionar carbonato de sódio para regular qualquer queda pH criado pela adição de reagente de Folin o. </li><li> Adicionar carbonato de sódio, as amostras de teste e test em branco. Essas soluções tornam-se nublado, após a adição de carbonato de sódio. Adicionar o reagente Folin, que vai reagir principalmente com tirosina livre. </li><li> Misture os frascos dram por agitação e incubar a 37 ° C por 30 minutos. </li></ol> Após esta incubação, você deve observar que os padrões têm uma gradação de cor correlacionando-se com a quantidade de tirosina acrescentado; as maiores concentrações de tirosina mais escura aparecendo. Você pode notar também mudam de cor em amostras apreciável nosso teste. 2mls destas soluções são filtradas usando uma seringa de 0,45 polietersulfona filtro em cuvetes adequado. Agora que o ensaio é realizado, você pode avançar para o espectrofotômetro para gravar os nossos valores de absorbância. </li></ol> Medição de absorbância e Calculando Atividade Enzimática <ol><li> A absorbância das amostras é medida por um espectrofotômetro usando um comprimento de onda de 660 nm. O caminho da luz é definida como um centímetro. Registrar os valores de absorbância para os padrões, em branco padrão, as amostras de teste diferentes, e ensaio em branco. Depois de todos os dados tenham sido coletados, a curva padrão pode ser criado. , A fim de gerar a curva de diferença, em absorbância entre o branco ea norma deve ser calculado. Este é o valor de absorbância atribuível à quantidade de tirosina nas soluções padrão. Após esse cálculo simples, criar a curva padrão, utilizando um programa gráfico para plotar a variação da absorvância de nossos padrões no eixo Y, em relação ao montante em micromoles para cada um dos nossos 5 normas sobre o eixo X. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume de padrão de tirosina </th><th style="text-align:center"> Tirosina uMoles </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Depois de pontos de dados foram inseridos, geram uma linha de melhor ajuste e inclinação equação correspondente. Encontrar a variação de absorvância das amostras de teste através do cálculo da diferença entre a absorbância da amostra de teste ea absorbância do ensaio em branco. Inserindo o valor de absorbância para uma das amostras na equação inclinação e resolução resultará na micromoles de tirosina liberada durante esta reação proteolítica particular. Para obter a atividade da enzima em unidades por / ml, executar o seguinte cálculo: (Umole equivalentes tirosina liberada) x (11) Unidades / ml = Enzyme __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = volume total (em mililitros) de ensaio 10 = Tempo de ensaio (em minutos) de acordo com a definição da Unidade 1 = Volume da enzima (em mililitros) de enzima usada 2 = Volume (em mililitros) utilizados na determinação colorimétrica Tome o número de equivalentes micromoles tirosina liberados obtidos a partir da equação inclinação e multiplicá-lo pelo volume total do ensaio em mls, que no nosso caso é 11mls. Divida esse valor por três outras quantidades: o tempo do ensaio, que durou 10 minutos, o volume de enzima utilizada no ensaio, que foi variado (vamos usar 1ml), o volume de mililitros usado na detecção colorimétrica, o que pode diferem com base em seu cuvete. Nós usamos 2 mls. </li><li> Micromoles de tirosina dividida pelo tempo em minutos de medição rendimentos da atividade da protease chamado de &quot;unidades&quot;. Podemos cancelar as unidades de medição de volume no numerador e denominador, deixando um measurment da atividade enzimática em termos de unidades / ml. A fim de determinar a atividade em uma amostra sólida protease diluído em diluente enzima, dividimos a nossa actividade em unidades / ml pela concentração de sólidos utilizados neste ensaio originalmente em mg / ml., Deixando-nos com a atividade em termos de unidades / mg . Unidades / ml de enzima Unidades / mg sólida = _____________________ mg sólido / ml de enzima </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

Nós apenas mostramos como analisar a atividade da protease usando ensaio da Sigma atividade universal protease. Além disso, este ensaio é útil para garantir que nossos proteases têm precisamente determinada atividade antes de recebê-los para suas experiências. Como você viu, ao fazer este procedimento, é de fundamental importância para lembrar para aquecer tanto a caseína e soluções tirosina lentamente e não fervê-los. Além disso, é fundamental para preparar espaços diferentes para ambos os padrões do seu e para cada amostra de teste que você tem.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio, Dibásico, Tri-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Caseína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Tricloroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Fenólico de Folin &amp; Ciocalteu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de Sódio, Anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio, Tri-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirosina, Base Livre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Kit Perfilador de Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Detecção Fluorescente de Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

não-específicas da sigma ensaio de atividade de protease - a caseína como substrato

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases, que é o que fazemos durante os nossos procedimentos de controle de qualidade. Neste ensaio, a caseína atua como um substrato. Quando a protease estamos testando digere caseína, o aminoácido tirosina é liberado junto com outros aminoácidos e fragmentos peptídicos. Reagente Folin e Ciocalteus Fenol, ou de Folin principalmente reage com tirosina livre para produzir um cromóforo de cor azul, que é quantificável e medida como um valor de absorbância no espectrofotômetro. Quanto mais tirosina que é liberado a partir de caseína, mais os cromóforos são geradas e mais forte é a atividade da protease. Valores de absorbância gerada pela atividade da protease são comparados a uma curva padrão, que é gerado pela reação de quantidades conhecidas de tirosina com o reagente FC para correlacionar mudanças na absorbância com a quantidade de tirosina em micromoles. Partir da curva padrão da atividade de protease amostras pode ser determinado em termos de unidades, que é a quantidade em micromoles de equivalentes de tirosina liberada a partir de caseína por minuto. Para ver este artigo em chinês, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">clique aqui</a>

Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases.

Não-específicas da Sigma ensaio de atividade de protease - A caseína como substrato

As proteases rompem ligações peptídicas. No laboratório, frequentemente é necessário medir e/ou comparar a atividade de proteases. A protease não específica da Sigma...

As proteases quebram ligações peptídicas no laboratório. Muitas vezes é necessário medir ou comparar a atividade de proteases da Sigma. O ensaio universal de atividade de protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases, o que fazemos durante nossos procedimentos de controle de qualidade.Neste ensaio, a casiana atua como substrato quando a protease que estamos testando digere a casiana. O aminoácido tirosina é liberado juntamente com outros aminoácidos e fragmentos peptídicos. A tirosina livre reage então com o fenol da reagente de Folin-Ciocalteu ou reagente de Folin para produzir um cromóforo de cor azul, que é quantificável e medido como um valor de absorbância no espectrofotômetro.Quanto mais tirosina for liberada da casaina, mais cromóforos serão gerados e maior será a atividade da protease. Os valores de absorbância gerados pela atividade da protease são comparados a uma curva padrão, que é obtida pela reação de quantidades conhecidas de tirosina com o reagente FC, a fim de correlacionar as alterações na absorbância. A partir da quantidade de tirosina em mícromols obtida pela curva padrão, a atividade das amostras de protease pode ser determinada em unidades, ou seja, a quantidade de mícromols de equivalência de tirosina liberada da casaina por minuto. Olá, meu nome é Carrie Cup Vineyard e sou cientista na nossa instalação Sigma Aldridge DeKalb aqui em St. Louis, Missouri.Hoje, vou mostrar a vocês um método universalmente aplicável para testar a atividade de protease na Sigma Aldridge. Utilizamos principalmente este ensaio em nossa área de controle de qualidade para garantir que nossa protease tenha atividade suficiente antes de enviá-la diretamente para vocês em seu laboratório. Antes de iniciar o ensaio, precisamos garantir que os seguintes reagentes estejam corretamente preparados.Um tampão de fosfato de potássio 50 milimolar, pH 7,5. A solução é colocada a 37 graus Celsius antes do uso. Uma solução de kasian 0,65% peso por volume, preparada pela mistura de 6,5 miligramas por mililitro em um litro. A temperatura da solução é aumentada gradualmente, com agitação suave, para 80 a 85 graus Celsius durante cerca de 10 minutos, até que uma dispersão homogênea seja obtida.É muito importante não ferver a solução. Em seguida, o pH é ajustado, se necessário, com hidróxido de sódio e ácido clorídrico. Uma solução de ácido tricloroacético 110 milimolar é preparada diluindo-se um estoque 6,1 normal na proporção de 1 para 55 com água purificada 0,5 milimolar, cloretos de cálcio ou reagente fenólico, que é a solução que reagirá com a tirosina para gerar uma mudança de cor mensurável.Isso estará diretamente relacionado à atividade das proteases. Uma solução de carbonato de sódio 500 milimolar preparada com 53 miligramas por mililitro de carbonato de sódio anidro em água purificada, uma solução diluente de enzima, que consiste em tampão de acetato de sódio 10 milimolar com cálcio 5 milimolar pH 7,5 a 37 graus Celsius. Essa solução é a que utilizamos para dissolver amostras sólidas de protease ou diluir soluções enzimáticas.A solução estoque padrão de L-tirosina, que deve ter uma concentração inicial de 1,1 milimolar, uma solução de 0,2 miligrama por mililitro de L-tirosina, é preparada em água purificada e aquecida suavemente até que a tirosina se dissolva. Da mesma forma que com a casiana, não aqueça esta solução até a fervura. Deixe o padrão de L-tirosina esfriar até a temperatura ambiente.Essa solução será diluída adicionalmente para preparar nossa curva padrão, se necessário, utilizando uma amostra sólida de protease com atividade previamente determinada, a qual é dissolvida com diluente enzimático até 0,1 a 0,2 unidades por mililitro. Essa solução serve como controle positivo no ensaio de controle de qualidade e como validação para os cálculos que realizaremos para determinar a atividade enzimática. Agora que preparamos nossos reagentes e todos estão na temperatura correta, iniciaremos nosso ensaio de protease.Para iniciar este ensaio, encontre frascos apropriados que comportem cerca de 15 mililitros. Para cada enzima que você for testar, serão necessários quatro frascos. Um frasco será usado como branco, e outros três serão utilizados para avaliar a atividade de três amostras.A diluição da protease em três diluições é útil ao verificar nossos cálculos finais um contra o outro, distribuindo cada conjunto de quatro frascos com cinco mililitros da nossa solução de 0,65% de kasian e deixando-os equilibrar em banho-maria a 37 graus Celsius por cerca de cinco minutos. Em seguida, adicione concentrações variadas da nossa solução de enzima a três dos frascos da amostra-teste, mas não ao branco. Misture-os girando suavemente e incube a 37 graus Celsius por exatamente 10 minutos.A atividade da protease e a liberação consequente de tirosina durante este período de incubação serão medidas e comparadas entre nossas amostras de teste. Após esta incubação de 10 minutos, adicione cinco mililitros do reagente TCA a cada tubo. Em seguida, um volume apropriado de solução enzimática é adicionado a cada tubo, inclusive ao branco, de modo que o volume final da solução enzimática em cada tubo seja de um mililitro.Isso é feito para levar em conta o valor de absorbância da própria enzima. Agora, incube as soluções a 30 graus Celsius por 30 minutos. Durante essa incubação de 30 minutos, você pode preparar as diluições do padrão de tirosina, o que é feito utilizando seis frascos DR.Isso pode facilmente acomodar oito mililitros nos seis frascos. A solução estoque padrão de tirosina 1,1 milimolar é adicionada com os seguintes volumes em mililitros: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 e 0,5. Não adicione nenhum padrão de tirosina ao branco.Pode ser necessário usar padrões mais baixos para amostras de teste da IPU que apresentarão pouca mudança de cor. Após a adição da solução padrão de tirosina, adicione um volume apropriado de água purificada a cada um dos padrões para completar o volume até dois mililitros. Após a incubação, filtre cada uma das soluções de teste e a amostra em branco.Usando um filtro de seringa de 0,45 mícron, dois mililitros das amostras de teste e do filtrado em branco são então adicionados a quatro frascos DR que podem conter pelo menos oito mililitros. Você pode usar o mesmo tipo de frasco no qual os padrões foram preparados; a todos os frascos contendo os padrões e o branco padrão, adiciona-se cinco mililitros de carbonato de sódio e, para melhores resultados, o reagente recém-adicionado é adicionado imediatamente em seguida; o carbonato de sódio é então adicionado às nossas amostras de teste e ao branco de teste. Você observará que essas soluções ficam turvas após a adição do carbonato de sódio.Em seguida, adiciona-se o reagente ninfaleno, que reagirá com a tirosina livre. Os frascos DRAM são então misturados por agitação suave e incubados a 37 graus Celsius por 30 minutos após essa incubação. Você deverá observar que os padrões apresentam uma graduação de cor que se correlaciona com a quantidade de tirosina adicionada, sendo as concentrações mais altas de tirosina as que aparecem mais escuras.Você também pode observar uma mudança de cor acentuada em nossas amostras de teste. Dois mililitros dessas soluções são filtrados usando um filtro de seringa de 0,45 mícrons e cubetas apropriadas. Agora que concluímos nosso ensaio, vamos prosseguir para o espectrofotômetro e registrar nossos valores de absorbância.A absorbância das nossas amostras é medida por um espectrofotômetro utilizando um comprimento de onda de 660 nanômetros. O caminho óptico é ajustado para um centímetro; registram-se os valores de absorbância para o branco padrão, os diferentes padrões, as amostras de teste e o branco de teste. Após a coleta de todos os dados, estamos prontos para criar a nossa curva padrão.Para gerar a curva, é necessário calcular a diferença de absorbância entre o padrão e a amostra em branco do padrão. Esse valor de absorbância corresponde à quantidade de tirosina nas soluções padrão. Após esse cálculo simples, criamos nossa curva padrão plotando a variação da absorbância dos nossos padrões no eixo Y versus a quantidade em micromoles para cada um dos cinco padrões no eixo X.Uma vez que tenhamos inserido nossos pontos de dados e gerado uma linha de melhor ajuste, determinamos a variação na absorbância das nossas amostras-teste calculando a diferença entre a absorbância da amostra-teste e a absorbância do branco-teste. Observando a nossa curva padrão, identificamos o valor de absorbância de uma das nossas amostras-teste no eixo Y. Em seguida, traçamos uma linha paralela ao eixo X até o ponto em que interceptamos a curva padrão.Então, a partir da coordenada X obtida neste ponto, temos a quantidade em micromols de tirosina liberada durante esta reação proteolítica específica. Para obter a atividade da enzima em unidades por mililitro, realize o seguinte cálculo: tome o número de micromols de equivalentes de tirosina liberados, obtido a partir da curva padrão, e multiplique-o pelo volume total do ensaio em mililitros, que no nosso caso é 11 mililitros. Em seguida, divida este valor por outras três quantidades.O tempo do ensaio, que realizamos por 10 minutos, o volume de enzima utilizado no ensaio, que foi variado. Vamos usar um mililitro. O volume de mililitros utilizado na detecção clorométrica, que pode diferir com base no seu Q vet.Utilizamos dois mililitros. Micromols de tirosina divididos pelo tempo em minutos nos fornecem a nossa medida de atividade proteolítica, que denominamos unidades. Podemos cancelar as unidades de medida de volume no numerador e no denominador e, portanto, restará uma medida de atividade enzimática em termos de unidades por mililitro.Para determinar a atividade em uma amostra sólida de protease diluída em diluente enzimático, dividimos nossa atividade em unidades por mililitro pela concentração do sólido utilizado originalmente neste ensaio em miligrama por mililitro, obtendo assim a atividade em unidades por miligrama. Acabamos de mostrar como analisar a atividade de protease utilizando o ensaio universal de atividade de protease da Sigma. Como você pôde observar ao realizar este procedimento, é fundamental lembrar-se de aquecer lentamente tanto as soluções de caseína quanto de tirosina, sem levá-las à ebulição.Além disso, é essencial preparar brancos diferentes tanto para os seus padrões quanto para cada amostra-teste que você tiver. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com suas atividades de protease.

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