Name: In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-02T13:52:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Aprenda a reconstituir núcleos in vitro usando extratos de ovo de Xenopus e cromatina de esperma. Este método permite estudar a formação de membranas nucleares e complexos de poros em biologia celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">protocolos atuais em Biologia Celular</a> .

Os autores não têm nada a declarar.

in vitro assembléia nuclear usando extractos egg fracionado xenopus

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Montagem membrana nuclear é um passo essencial no ciclo de divisão celular, este processo pode ser replicado no tubo de ensaio, combinando Xenopus cromatina de espermatozóides, citosol, e frações de membrana luz. Núcleos são formados completa, incluindo membranas nuclear com complexos de poros, e estes núcleos reconstituídos são capazes de processos normais de nuclear.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

A montagem da membrana nuclear é uma etapa essencial no ciclo de divisão celular; este processo pode ser replicado em tubo de ensaio combinando espermatozoides de Xenopus ...

Extratos de ovos de Xip Labus são úteis como material citoplasmático e de organelas para a reconstrução in vitro de eventos celulares, como montagem do núcleo e importação de proteínas nucleares. Quando se adiciona DNA de cromatina espermática a extratos de ovos XUS brutos ou fracionados, vesículas de membrana presentes no extrato ligam-se à superfície da cromatina, fundem-se e incorporam componentes dos poros nucleares para formar núcleos sintéticos plenamente funcionais. A caracterização da base molecular desses processos torna-se então possível por imunodepleção dos extratos e por edição proteica.Olá, meu nome é Marie Cross e sou aluna de pós-graduação no laboratório da Dra. Maureen Power, do Departamento de Biologia Celular da Universidade Emory, em Atlanta, Geórgia. Hoje vamos mostrar como formar núcleos in vitro utilizando extratos de ovos de Xenopus fracionados. Este procedimento envolve as seguintes etapas: realizar a reação de montagem nuclear e avaliar a formação de núcleos.Então vamos começar. Para iniciar a montagem nuclear, retire uma alíquota de citosol fracionado e adicione fosfocreatina de um estoque 0,2 molar até uma concentração final de 20 milimolares. Em seguida, adicione creatina quinase de um estoque de 5 miligramas por mililitro até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.Por fim, adicione ATP 20 micromolar utilizando um estoque 0,2 molar. Em seguida, adicione membranas leves ao citosol em uma diluição de um para 10. Isso aproxima a quantidade de membrana presente no extrato bruto original.Misture todos os componentes por pipetagem para cima e para baixo para dispersar as membranas no extrato. Isso deve ser feito antes da adição da cromatina espermática. Em seguida, adicione a cromatina espermática ao extrato fracionado na concentração desejada e misture imediatamente o extrato e a cromatina com pipetagem suave para cima e para baixo, utilizando uma ponteira com ponta cortada.Quando a cromatina espermática é adicionada ao extrato, ela imediatamente começa a se descondensar, condensar e tornar suscetível à cisalhamento. Geralmente, essas reações são montadas em tubos de centrífuga de 500 microlitros com um volume total inferior a cem microlitros. Os extratos de ovo suportarão a formação de até 8.000 a 9.000.Incube a mistura por uma a duas horas à temperatura ambiente para permitir a formação dos núcleos por microlitro. Os núcleos são visualizados por meio de coloração. Após aproximadamente 30 minutos, os núcleos recém-formados serão pequenos e com formato oval.O DNA ainda está bastante condensado e o núcleo deve parecer uma mancha azul-clara sólida ao observar o espermatozoide em ganchos no canal UV à medida que o DNA se condensa. Além disso, a coloração azul será menos homogênea, com lacunas pretas aparecendo eventualmente. A formação da membrana nuclear pode ser visualizada pela adição de um micrograma por macho de três três diaa carboxilamina ou DHCC no fixador.DHCC é um corante lipofílico fluorescente que é visualizado no canal da fluoresceína. Nos estágios iniciais da montagem dos núcleos, vesículas da membrana se ligam à superfície da cromatina e começam a se fundir em remendos. Isso resulta em uma aparência irregular e descontínua da membrana em formação.Uma vez que a membrana está completa, ela se acomoda sobre a superfície nuclear e aparecerá como uma borda uniforme e contínua ao redor do DNA. Haverá uma quantidade considerável de fluorescência de fundo no citosol circundante devido às vesículas da membrana, que não foram incorporadas aos núcleos. Acabamos de mostrar a reconstituição nuclear in vitro utilizando frações solúvel e leve de membrana do extrato de ovo de Xenopus.É importante lembrar que o extrato bruto pode ser usado para montagem nuclear, mas não após congelamento e descongelamento. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

in-vitro-nuclear-assembly-using-fractionated-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Extratos de ovo cru e fracionado Xenopus pode ser usado para fornecer ingredientes para reconstituir processos celulares para análise morfológica e bioquímica. Lise de ovo e centrifugação diferencial são usados ​​para preparar o extrato bruto que, por sua vez, usado para preparar extratos fracionados e preparações de membrana de luz.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática...

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de...

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Produção de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrai identificar RNAs associada aos microtúbulos

Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Os mecanismos moleculares de descondensação da cromatina mitótica altamente compactada são mal definidos. Apresentamos um ensaio livre de células baseado em aglomerados de cromatina mitótica isolados de células HeLa e extrato de ovo de Xenopus laevis que reconstitui fielmente o processo de descondensação in vitro.

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

Descrevemos um sistema de capas de oócitos e animais de Xenopus para a clonagem de expressão de genes capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente, e discutimos técnicas para a análise subsequente de tais genes. Este sistema é útil na identificação funcional de uma ampla gama de produtos gênicos.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Os mecanismos de escalonamento celular e intracelular permanecem indescritíveis. O uso de extratos de embriões de Xenopus tem se tornado cada vez mais comum para elucidar mecanismos de regulação do tamanho das organelas. Este método descreve a preparação do extrato de embrião e um novo ensaio de escala nuclear através do qual os mecanismos de regulação do tamanho nuclear podem ser identificados.

Um ensaio-Free Cell Usando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrai para estudar mecanismos de regulação Tamanho Nuclear

Nós apresentamos um método para a geração de em vitro auto-sustentado mitótica oscilações no nível de célula única encapsulando extratos de ovos de Xenopus laevis em microemulsões de água em óleo.

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica

Aprenda a reconstituir núcleos in vitro usando extratos de ovo de Xenopus e cromatina de esperma. Este método permite estudar a formação de membranas nucleares e complexos de poros em biologia celular.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Explorar mais vídeos