In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Extratos de ovos de Xip Labus são úteis como material citoplasmático e de organelas para a reconstrução in vitro de eventos celulares, como montagem do núcleo e importação de proteínas nucleares. Quando se adiciona DNA de cromatina espermática a extratos de ovos XUS brutos ou fracionados, vesículas de membrana presentes no extrato ligam-se à superfície da cromatina, fundem-se e incorporam componentes dos poros nucleares para formar núcleos sintéticos plenamente funcionais. A caracterização da base molecular desses processos torna-se então possível por imunodepleção dos extratos e por edição proteica.

Olá, meu nome é Marie Cross e sou aluna de pós-graduação no laboratório da Dra. Maureen Power, do Departamento de Biologia Celular da Universidade Emory, em Atlanta, Geórgia. Hoje vamos mostrar como formar núcleos in vitro utilizando extratos de ovos de Xenopus fracionados. Este procedimento envolve as seguintes etapas: realizar a reação de montagem nuclear e avaliar a formação de núcleos.

Então vamos começar. Para iniciar a montagem nuclear, retire uma alíquota de citosol fracionado e adicione fosfocreatina de um estoque 0,2 molar até uma concentração final de 20 milimolares. Em seguida, adicione creatina quinase de um estoque de 5 miligramas por mililitro até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.

Por fim, adicione ATP 20 micromolar utilizando um estoque 0,2 molar. Em seguida, adicione membranas leves ao citosol em uma diluição de um para 10. Isso aproxima a quantidade de membrana presente no extrato bruto original.

Misture todos os componentes por pipetagem para cima e para baixo para dispersar as membranas no extrato. Isso deve ser feito antes da adição da cromatina espermática. Em seguida, adicione a cromatina espermática ao extrato fracionado na concentração desejada e misture imediatamente o extrato e a cromatina com pipetagem suave para cima e para baixo, utilizando uma ponteira com ponta cortada.

Quando a cromatina espermática é adicionada ao extrato, ela imediatamente começa a se descondensar, condensar e tornar suscetível à cisalhamento. Geralmente, essas reações são montadas em tubos de centrífuga de 500 microlitros com um volume total inferior a cem microlitros. Os extratos de ovo suportarão a formação de até 8.000 a 9.000.

Incube a mistura por uma a duas horas à temperatura ambiente para permitir a formação dos núcleos por microlitro. Os núcleos são visualizados por meio de coloração. Após aproximadamente 30 minutos, os núcleos recém-formados serão pequenos e com formato oval.

O DNA ainda está bastante condensado e o núcleo deve parecer uma mancha azul-clara sólida ao observar o espermatozoide em ganchos no canal UV à medida que o DNA se condensa. Além disso, a coloração azul será menos homogênea, com lacunas pretas aparecendo eventualmente. A formação da membrana nuclear pode ser visualizada pela adição de um micrograma por macho de três três diaa carboxilamina ou DHCC no fixador.

DHCC é um corante lipofílico fluorescente que é visualizado no canal da fluoresceína. Nos estágios iniciais da montagem dos núcleos, vesículas da membrana se ligam à superfície da cromatina e começam a se fundir em remendos. Isso resulta em uma aparência irregular e descontínua da membrana em formação.

Uma vez que a membrana está completa, ela se acomoda sobre a superfície nuclear e aparecerá como uma borda uniforme e contínua ao redor do DNA. Haverá uma quantidade considerável de fluorescência de fundo no citosol circundante devido às vesículas da membrana, que não foram incorporadas aos núcleos. Acabamos de mostrar a reconstituição nuclear in vitro utilizando frações solúvel e leve de membrana do extrato de ovo de Xenopus.

É importante lembrar que o extrato bruto pode ser usado para montagem nuclear, mas não após congelamento e descongelamento. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.