Name: Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a manipular neurônios cultivados in vitro usando pinças ópticas a laser. Este método permite capturar e mover células com precisão para estudar interações neuronais em neurociência.

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Pesquisa foi suportada pelo NIH Grants EY012031 e EY0182175 ea FM Kirby Foundation.

Pinça óptica para manipulação de células isoladas em cultura Forças aprisionamento de pinças ópticas são gerados a partir do impulso de luz (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Embora estas forças facilmente armadilha células em suspensão, eles não são capazes de mover as células que aderem a uma superfície. Portanto, para reduzir a adesão ao prato de cultura no ponto onde as células estão presos, a lamela é revestido com poli-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), um composto não tóxico com célula repelente propriedades anteriormente empregados para estudos de adesão em células endoteliais (Folkman e Moscona, 1978). Enquanto poli-HEMA cobre metade da placa de cultura, a outra metade é revestido com um substrato que suporta o crescimento celular. Em nosso laboratório, Sal-1 é usado como substrato para a cultura de células da retina salamandra. O procedimento para a fabricação de Sal-1 e poli-HEMA pratos revestido é descrito abaixo: Fabricação de placas de cultura <ol><li> Esfregaços limpa (# 1 VWR Scientific Inc., Media, PA) em ácido. Esta lamela foi escolhida pela sua espessura de apenas 0,1 milímetros, necessária para a alta objetivos abertura numérica necessário para focar o laser. </li><li> Para criar uma área de repelente de células, dissolver 20 mg de poli-HEMA (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) em 1ml de etanol 95% durante a noite a temperatura ambiente. De preferência, esta solução deve ser utilizada dentro de 1 mês de preparação. </li><li> Escorar o esfregaços em uma posição quase vertical em um ambiente livre de poeira, como um capuz. </li><li> Coloque uma ou duas gotas de poli-HEMA solução perto do topo da lamela da ponta de plástico de uma micropipeta 200μl. As gotas (cerca de 50-100μl cada) deve ser restrito à metade da lamela. O declive íngreme garante que o líquido flui para baixo da superfície da lamela para o fundo, proporcionando uma camada fina e uniforme de poli-HEMA. Permitir que o esfregaços poli-HEMA revestido para secar o capô por 30-60 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Marcar o lado do poli-HEMA da lamela com uma caneta de ponta fina perto da borda. </li><li> Faça um furo de 1 cm no fundo de um prato de cultura 35 mm. </li><li> Cole a lamela poli-HEMA revestidos para o fundo do prato de cultura com Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI), de modo que o lado poli-HEMA revestido faces em direção ao interior do prato. Garantir a borda do revestimento de poli-HEMA corre abaixo do centro do buraco. Permitir que os pratos para secar por 1-3 dias em temperatura ambiente em um ambiente livre de poeira. </li><li> Riscar uma linha na parte externa da lamínula com uma caneta de ponta de diamante após a borda do revestimento de poli-HEMA. Então, nada duas linhas cruzam em ângulos retos a ele cerca de 2 milímetros de distância. Os dois pontos de interseção servem de referência ou pontos fiducial a ser utilizado para reproduzir a mesma orientação da placa de cultura no palco microscópio. </li><li> Esterilizar os pratos sob luz ultravioleta durante a noite. </li><li> Para criar uma meia-célula de adepto da placa de cultura, o revestimento do meia poli-HEMA não com Sal-1, que contém um rato de anticorpos anti-salamandra levantadas contra as membranas das células da retina (generosamente fornecida pelo Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine , Atlanta, GA; ver MacLeish et al (1983)).. Primeira camada, o Sal-1 lado com cerca de 100μl de 0,1 mg / ml estéril cabra anti-camundongo IgG (Boehringer Mannheim Corporation, Indianápolis IN), tomando cuidado para não derramar o líquido sobre para o lado poli-HEMA. Deixe por três horas, depois removê-lo. Lave a mesma área com solução de Ringer estéril de uma ou duas vezes, em seguida, coloque 100μl Sal-1 sobrenadante, tomando cuidado para não derramar o líquido no lado poli-HEMA do prato. O primeiro anticorpo garante Sal-1 é revestido com uma concentração conhecida. </li><li> Incubar os pratos com o overnight Sal-1. </li><li> Remover a solução Sal-1 anticorpo e lavar a área com solução de Ringer é estéril. Introduzir 2 ml de meio para o prato pouco antes do revestimento celular. </li></ol> A composição da solução Ringer anfíbios, sem soro meio anfíbio, e solução de Ringer para a digestão enzimática são encontradas em MacLeish e Townes-Anderson (1988) e Mandell et al. (1993). Preparação de culturas de células As células utilizadas neste vídeo foram obtidos a partir de luz adaptados, adulto, aquáticos fase salamandras tigre (Ambystoma tigrinum), medindo 17-22 cm de comprimento (Charles Sullivan Inc., de Nashville, TN), mantido a 5 ° C em um 12 h: 12 h ciclo claro-escuro. Os protocolos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey em estrita conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health. Os procedimentos para a preparação de culturas de células da retina são descritos por Nachman-Clewner e Townes-Anderson (1996) e são as seguintes: <ol><li> Decapitar e medula dos animais. Remove os olhos e dissecar as córneas e íris. O retinas deve separar um pouco dentro da ocular. Ao colocar uma pinça curva debaixo da retina, colher as retinas. Não é importante se a lente está ligado à retina nesta fase. </li><li> Digerir as retinas em 14 U / ml papaína (Worthington, Freehold, NJ) em solução de Ringer com salamandra por 40 minutos. </li><li> Antes do uso, a solução Ringer papaína deve ser aeradas com 95% O 2 / 5% CO 2 gás por 30 minutos. E depois esterilizados por passagem através de um filtro de 0,22 mícron (Millipore, Carrigtwohill, Irlanda). </li><li> Lave as retinas com solução fisiológica de Ringer com salamandra três vezes. </li><li> Remover as lentes de solução de Ringer, em seguida, delicadamente triturar o tecido da retina com um furo de 3 mm pipeta para produzir uma suspensão de células. </li></ol> Laser manipulação de pinças de neurônios isolados <ol><li> Coloque a placa de cultura no palco microscópio, orientando o prato, alinhando uma marca no prato com um ponto de referência no palco. Gravar as coordenadas dos pontos de referência no computador. </li><li> Células chapa para ambos os Sal-1 e poli-HEMA metades do prato. </li><li> Permitir que as células de se contentar com cerca de 20 minutos, que é longo o suficiente para as células do lado aderente do prato para anexar ao substrato de anticorpos. </li><li> Selecione uma célula do lado Sal-1 aderente do prato. Marque o x e estágio y coordenadas de uma posição próxima à célula. No nosso caso, o ponto foi de aproximadamente 10μm a partir dos dendritos primária da célula selecionada. Guardar as coordenadas no computador. </li><li> Selecione um segundo neurônio, no nosso caso um fotorreceptor, no lado poli-HEMA do prato e use a ferramenta de pinça a laser para prendê-lo. Trapping pode ser alcançado através de uma ampla gama de níveis de potência. No entanto, vamos definir o poder do laser em 10% -20%, o que é baixo o suficiente para evitar detritos captura junto com o celular, mas suficiente para transportar o celular através do médium. </li><li> Enquanto segura o celular na armadilha, menor o palco para que a célula está bem acima da superfície da placa de cultura e acima de qualquer neurônios conectados. Mover o palco sob o controle do computador para levar a célula à x salvo anteriormente e coordenadas y no-1 Sal lado. O movimento de estágio foi fixado em 8-20Hm / s, mas a velocidade máxima deve ser determinada empiricamente. À chegada ao ponto de destino no-1 Sal lado, aumentar o palco para levar o celular preso à superfície do prato. Colocação de células pode ser feita com uma precisão de alguns mícrons. Permitem que as células aderem ao substrato Sal-1. </li><li> Obtenção de imagens digitalizadas de ambas as células no par antes e depois da formação de pares fornece um registro útil. </li><li> Manter os pares de células em uma incubadora. Para as células da salamandra, coloque os pratos em uma câmara úmida a 10 ° C. As células podem ser monitorados por lapso de tempo de vídeo e usado com qualquer técnica de células biológicas necessárias. </li></ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+Single-Beam+Gradient+Force+Optical+Trap+for+Dielectric+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles.</a> Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).</li>
<li>Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+cells+have+different+target+preferences+in+vitro+as+revealed+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vision%22%5BJournal%5D)">Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers.</a> Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+localized+cell+heating+induced+by+infrared+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).</li>
<li>MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).</li>
<li>MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synapse+formation+among+major+classes+of+adult+salamander+retinal+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro.</a> Neuron. 1, 751-760 (1988).</li>
<li>Mandell, J. W., MacLeish, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Townes-Anderson+E.+Process+outgrowth+and+synaptic+varicosity+formation+by+adult+photoreceptors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro.</a> J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).</li>
<li>Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-induced+remodelling+and+regeneration+of+the+ribbon+presynaptic+terminal+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro.</a> J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).</li>
<li>Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+retinal+neurons+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis.%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers.</a> Mol. Vis.. 4, (1998).</li>
</ol>

A luz tem força, e quando um raio de luz é refratada ao passar através de uma célula, uma força é necessária para mudar a direção do momentum. Por causa da lei da conservação do momento, uma força na direção oposta deve, por sua vez, reagem de volta em uma célula. Ashkin (1991) mostrou que a força gerada por um feixe de laser focalizado por uma lente objetiva do microscópio irá mover uma célula para o centro do foco. Mesmo que um feixe de laser gera apenas uma piconewtons alguns de força, essa força é suficiente para puxar uma célula atravé...

<table><tbody><tr><td>Cobertura circular de 25 mm, número 1</td><td>VWR international</td><td>48380 080</td><td></td></tr><tr><td>Polímero de 2-hidroxietilmetacrilato (poly-HEMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3932</td><td>Dissolver em etanol a 95%</td></tr><tr><td>Anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo</td><td>Chemicon International</td><td>AP181</td><td>1 mg em 1 ml, diluir 10 vezes para uso</td></tr><tr><td>Supernatante Sal-1 contendo anticorpo de camundongo anti-salamandra</td><td>fornecido gentilmente pelo Dr. Peter MacLeish</td><td></td><td>Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA</td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis de 5 ml com diâmetro interno de 3 mm, em pirex</td><td>Corning</td><td>7078A-5</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura celular de 35 mm x 10 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças ópticas-microferramenta ou pinças a laser</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser de diodo contínuo de 1 W com comprimento de onda de 980 nm</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Axiovert 100 de luz visível</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva plan neofluor de imersão a óleo 40x</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Abertura numérica (N.A. 1,3)</td></tr><tr><td>Câmera CCD preto e branco</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computador e joystick com software</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td>para controlar uma platina motorizada</td></tr></tbody></table>

usando uma pinça laser para manipulação neurônios isolados in vitro

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

Neste artigo e vídeo, descrevemos os protocolos utilizados em nosso laboratório para estudar as preferências de segmentação dos processos celulares regeneração de neurônios da retina adulta in vitro. Procedimentos para a preparação de culturas de células da retina começam com a dissecção digestão, e trituração da retina, e terminam com o chapeamento de isoladas as células da retina em pratos feitos especialmente para uso com laser pinças. Estes pratos são divididos em meia célula adesiva e meia repelente celular. O lado adesivo célula é revestida com uma camada de Sal-1 anticorpos, que fornecem um substrato sobre o qual nossas células crescer. Outros substratos adesivo pode ser usado para outros tipos celulares. O lado repelente célula é revestida com uma fina camada de poly-HEMA. As células banhado no lado poli-HEMA do prato são capturados com a pinça a laser, transportado e depois colocado adjacente a uma célula na-1 Sal lado para criar um par. Formação de grupos de células de qualquer tamanho deve ser possível com esta técnica. &quot;Micromanipulação Laser-pinças controlada&quot; significa que o pesquisador pode escolher quais as células a se mover, e a distância desejada entre as células podem ser padronizadas. Porque o feixe de laser atravessa as superfícies transparentes da placa de cultura, seleção e colocação de células são feitas em um ambiente fechado estéril. As células podem ser monitorados por vídeo em tempo-lapso e usado com qualquer técnica de células biológicas necessárias. Esta técnica pode ajudar as investigações de interações célula-célula.

Este vídeo descreve a manipulação de neurônios cultivados usando laser pinças in vitro.

Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro

Neste artigo e vídeo, descrevemos os protocolos utilizados em nosso laboratório para estudar as preferências de direcionamento de prolongamentos de células em regeneração de adultos...

Ashkin foi o primeiro a demonstrar que pinças a laser ou armadilhas ópticas são uma ferramenta poderosa para manipular objetos vivos microscópicos micronizados. Neste vídeo, mostraremos como aplicamos essa tecnologia para capturar e mover neurônios. Esta é a estação de trabalho de pinças ópticas.As setas verdes mostram o trajeto percorrido pelo feixe a laser através da óptica do microscópio. Quando um feixe a laser focalizado pela lente objetiva do microscópio é refratado por uma célula, a força que altera a direção do raio de luz atua sobre a célula, movendo-a em direção ao centro do foco.Isso gera piconewtons de força suficientes para puxar uma célula através do meio. Neste vídeo, vamos falar sobre a fabricação de placas, o preparo de células retinianas, o plaqueamento de células em placas de cultura, a manipulação com pinça óptica e a observação do crescimento celular. Como as células aderem ao vidro, precisamos criar uma área repelente a células onde elas possam ser facilmente aprisionadas com as pinças.Metade da placa foi revestida com poli-hema, um polímero repelente de células. A outra metade foi revestida com cell one, um substrato que suporta o crescimento de nossas célula

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Research

JoVE Journal

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Biologia

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