Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro

Ashkin foi o primeiro a demonstrar que pinças a laser ou armadilhas ópticas são uma ferramenta poderosa para manipular objetos vivos microscópicos micronizados. Neste vídeo, mostraremos como aplicamos essa tecnologia para capturar e mover neurônios. Esta é a estação de trabalho de pinças ópticas.

As setas verdes mostram o trajeto percorrido pelo feixe a laser através da óptica do microscópio. Quando um feixe a laser focalizado pela lente objetiva do microscópio é refratado por uma célula, a força que altera a direção do raio de luz atua sobre a célula, movendo-a em direção ao centro do foco.

Isso gera piconewtons de força suficientes para puxar uma célula através do meio. Neste vídeo, vamos falar sobre a fabricação de placas, o preparo de células retinianas, o plaqueamento de células em placas de cultura, a manipulação com pinça óptica e a observação do crescimento celular. Como as células aderem ao vidro, precisamos criar uma área repelente a células onde elas possam ser facilmente aprisionadas com as pinças.

Metade da placa foi revestida com poli-hema, um polímero repelente de células. A outra metade foi revestida com cell one, um substrato que suporta o crescimento de nossas células. Primeiro, uma célula é identificada no lado adesivo à célula da placa.

Em seguida, outra célula é aprisionada no lado do polímero e transportada para o lado adesivo, onde ambas as células são pareadas. Para preparar as placas, utilizamos placas de cultura esterilizadas de poliestireno soprado, de 35 milímetros. Primeiro, fazemos um orifício de um centímetro no fundo com um pequeno torno ou uma furadeira de bancada.

Retire as lamínulas limpas com ácido e coloque-as na vertical em um ambiente livre de poeira, como uma capela. Pegue a solução de poli-HEMA dissolvida em álcool a 95% e coloque algumas gotas próximo ao topo da lamínula, apenas em uma das metades. Deixe o poli-HEMA secar. Marque o lado da lamínula com o poli-HEMA.

Coloque a proteção S ao redor do orifício na parte inferior da placa de cultura. Cole o lamínula à placa com a proteção S. Certifique-se de que o poliamida esteja voltado para o interior e também verifique se não há vazamentos através das frestas da proteção da soleira.

Posicione a lamínula de modo que a borda do revestimento de poli-hema percorra o centro do recipiente. Deixe o recipiente secar por dois a três dias e, em seguida, risque o fundo do recipiente com uma caneta de ponta de diamante, fazendo marcas que servirão como pontos de referência para posicionar o recipiente na platina do microscópio. Coloque os recipientes na câmara de fluxo laminar e esterilize-os sob luz ultravioleta.

Coloque uma ou duas gotas da solução de anticorpo de cabra anti-US no lado não poliúrico da placa, tomando cuidado para não derramar sobre o revestimento polimérico e deixe por cerca de três horas. Remova e lave com solução fisiológica estéril. Coloque a solução do anticorpo primário na mesma área e incube durante a noite, preparando para o experimento no dia seguinte.

As células em nosso laboratório são derivadas de retinas de salamandras na fase aquática adulta. As retinas são dissecadas e removidas, digeridas com enzima e depois dissociadas. O prato de cultura pode então ser semeado com células isoladas.

Os olhos são removidos. A córnea é dissecada e removida. A cúpula ocular é colocada em solução de Ringer estéril.

A retina é separada da cúpula ocular escavando-a com a borda de uma pinça curva. Dióxido de carbono e oxigênio são borbulhados em uma solução de Ringer contendo propano e, em seguida, esterilizados por meio de um filtro ultrafino de 0,2 mícron. As retinas são colocadas na solução enzimática e digeridas por aproximadamente 40 minutos com agitação para dissociar o tecido.

Após três lavagens, as retinas são dissociadas por tri. Usando uma pipeta de bola de três milímetros, as células isoladas estão prontas para semeadura antes da semeadura. A placa de cultura contendo o meio é colocada sobre a platina do microscópio e orientada adequadamente utilizando as marcas de risco na parte inferior da placa.

Isso permite que a posição exata do recipiente seja duplicada em um momento posterior. As células são então semeadas em ambas as superfícies do recipiente, com poli-hema e com células. A posição do recipiente na platina do microscópio, bem como a potência do laser, é controlada com o joystick.

Primeiro, identificamos uma célula aderida a um lado da placa. Esta é uma célula multipolar retiniana identificável pelos seus dendritos. As coordenadas da posição da célula são salvas.

Esta é uma célula fotorreceptora bastão no lado do prato que repele células polares. O prato é abaixado e a célula é capturada pelo laser e levantada, afastando-se do fundo do prato. A célula está sendo agora transportada para o outro lado do prato, até as coordenadas da célula multipolar.

Na realidade, a célula está estacionária. É a placa que está se movendo. A célula está agora passando pela borda do revestimento de poli-hemo.

A saliência que se estende da célula é o terminal axonal. A célula está bem afastada de detritos e outras células no fundo da placa, os quais poderiam obstruir seu movimento. As imagens desfocadas de células no fundo da placa são visíveis ao fundo.

A célula em bastonete chega à célula multipolar e pode ser posicionada com precisão no ponto desejado e à distância desejada dessa célula. O recipiente é levantado e a célula adere ao substrato de uma célula. As principais vantagens deste procedimento são a possibilidade de escolher quais células mover e de realizar as manipulações em um experimento estéril fechado.

As interações entre células podem ser monitoradas por meio de vídeomicroscopia com lapso de tempo ou por fotografia digital. Pinças a laser podem ser usadas com qualquer técnica biológica. Aqui, por exemplo, uma técnica de fluorescência demonstra a presença de proteínas sinápticas nos pontos de conexão entre células movidas pelas pinças.