Name: Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Aprenda a usar ensaio de luciferase baseado em gene repórter para estudar biogênese de membrana durante fagocitose. Este método analisa regulação gênica pós-fagocitose de partículas.

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Cultura de células <ol><li> Culturas estoque de rim embrionário humano 293 (HEK293), as células são cultivadas em 10 cm de placas de cultura em &#39;A médio &quot;, consistindo de Medium Modified Dulbecco Águia (DMEM) suplementado com um coquetel de antibióticos (100 unidades por ml de penicilina e 100 mg por ml de sulfato de estreptomicina) e 10% de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Para configurar as células de um experimento, o meio é sugada, e as células são lavadas duas vezes com 5 ml de solução tampão fosfato (PBS). </li><li> O PBS é então removido e substituído por 0,6 ml de uma solução contendo tripsina 0,25%. </li><li> O prato é incubada a 37 ˚ C por cerca de 2 min até que as células começaram a destacar. </li><li> 5,5 ml de meio de A é adicionado para neutralizar o tripsina e as células são contadas com um hemocitômetro. </li><li> Células são diluídos para 320 mil células por ml e dispensados ​​em 0,1 ml por poço em um polilisina revestido de 96 poços placa de cultura. </li><li> Coloque o prato em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ˚ C com uma atmosfera contendo CO2 e crescer 8,8% por 24 hrs. </li></ol> Transfections <ol><li> Na preparação para transfections, deve-se considerar quantas repetições devem ser executadas por condições experimentais e que quantidades de plasmídeo será transfectadas. Nós rotineiramente todas as condições em triplicado e transfecção de um total de 50 a 100 ng de DNA plasmidial por poço. Mistura plasmídeo deve incluir pelo menos um repórter construir expressar firefly luciferase e um controle luciferase Renilla plasmídeo expressando a partir de um promotor constitutivo. </li><li> Soluções plasmídeo são pipetados em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e suplementado com 10 ml por amostra de DMEM sem soro e antibiótico-livre. Por exemplo, se 20 poços estão cada ser transfectadas com 50 mg de DNA, adicionar 200 mL de DMEM 1 mg de DNA. </li><li> Para a solução de DMEM / DNA adicionar 3 mL «Trânsito 293 reagente&quot; (Mirus) por mg de DNA. Mix pipetando cima e para baixo e deixar as amostras em repouso à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. </li><li> Durante este período, remova a mídia da 96 poços placa de cultura e substituir com 90 mL de meio fresco A. </li><li> A cada poço adicionar 10 ml de DMEM / DNA / trânsito 293 mistura. </li><li> Coloque o prato em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ˚ C com uma atmosfera contendo CO2 e crescer 8,8% por 24 hrs. </li></ol> Fagocitose <ol><li> Preparar suspensões contendo B médio (uma mistura 1:1 de DMEM e médias Ham F12 além de antibióticos e 10% FBS) acrescida de 0,75 mícrons esferas de látex em zero a 1 mg por ml. </li><li> Remova a mídia da 96 poços placa de cultura e substituir com 0,1 ml de suspensões talão no meio B. </li><li> Girar a placa de 2 min a 1000 x g. </li><li> As células são cultivadas em seguida, a 37 ˚ C por 6-16 horas. Dependendo das condições eo promotor usado para acionar luciferase, a expressão do gene repórter aumento pode ser detectado após 1 a 3 horas. </li><li> Mesmo em casos pode ser necessário para incubar as células com grânulos de 30 a 60 min, em seguida, fazer duas lavagens com PBS para remover contas sem personalidade jurídica, e adicionar novas mídias antes incubando as células por períodos adicionais de tempo. </li></ol> Dual-GloTM ensaio de luciferase <ol><li> Nota: o nosso protocolo para a utilização deste kit difere em alguns aspectos do que o recomendado pelo fabricante. Ele foi modificado para reduzir a quantidade de reagentes necessários por amostra. </li><li> Prepare uma solução de 1 M DTT, divida em várias pequenas alíquotas e armazenar a -20 ˚ C. </li><li> Preparar um tampão de lise contendo 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) de glicerol, e 0,5% (v / v) de Triton X-100. Antes do uso da alíquota, o montante necessário para a experiência e adicionar 1 ml por ml de 1 M DTT mais coquetel inibidor de protease para uma concentração final de 0,5 a 1x. Não reutilizar os restos de solução de TDT. </li><li> Ao usar o kit Dual-GloTM pela primeira vez, prepare o reagente (vagalume) luciferase, transferindo todo o conteúdo de um frasco de Dual-GloTM buffer luciferase (fornecido com o kit) para uma garrafa de Dual-GloTM substrato luciferase (desde com o kit). Divide o reagente não utilizado luciferase em 10 ml alíquotas e armazenar a -20 ˚ C. </li><li> Remova a placa de 96 poços da cultura de tecidos incubadora e colocá-lo no gelo. Remova a mídia por aspiração, adicionar 40 mL por poço de tampão de lise, e em seguida deixar a placa em gelo por 30 min. </li><li> Em uma branca, opaca de 96 poços da placa (OptiplateTM-96, Perkin Elmer número de catálogo 6005290) alíquota 15 mL por poço de Reagente luciferase, em seguida, adicionar 15 mL de lisado de células. </li><li> Incubar a placa em temperatura ambiente por 10 min e depois ler a luminescência em um leitor de microplacas. </li><li> Imediatamente antes do uso, prepare uma quantidade adequada de solução de substrato Renilla luciferase, adicionando uma parte Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; Reagente (fornecido com o kit) para 100 partes Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (fornecido com o kit). </li><li> A cada poço adicionar 15 mL por poço da solução de substrato Renilla luciferase, incubar em temperatura ambiente por 10 min e depois medir a luminescência novamente. </li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

estudando biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase gene-based reporter

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Para estudar a coordenação de diferentes vias de síntese de lipídios durante a biogênese membrana é útil para trabalhar com um sistema experimental, onde biogénese da membrana ocorre rapidamente e de forma induzida. Descobrimos que a fagocitose de esferas de látex é prático para esses fins como células rapidamente sintetizar lipídios de membrana para reabastecer piscinas membrana perdido como material de acondicionamento durante a imersão de partículas. Aqui, descrevemos os procedimentos para estudar mudanças na fagocitose induzida por expressão de genes com uma abordagem gene luciferase baseado repórter usando o Dual-Glo Sistema de ensaio de luciferase da Promega.

Aqui, descrevemos os procedimentos para estudar mudanças na fagocitose induzida por expressão de genes com uma abordagem gene luciferase baseado repórter usando o Dual-GloTM Sistema de ensaio de luciferase da Promega.

Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

Para estudar a coordenação de diferentes vias de síntese de lipídios durante a biogênese de membranas, é útil trabalhar com um sistema experimental onde a membrana...

Olá, sou IL OV, estudando a coordenação de diferentes vias de síntese de lipídios em relação à memória e à biogênese. É útil contar com um sistema experimental no qual a biogênese de membranas ocorra rapidamente e de forma induzível. Descobrimos que a fagocitose de microesferas de látex é particularmente útil para esses estudos, pois as células sintetizam rapidamente novas membranas para repor aquelas perdidas como material envolvente no início do processo de englobamento.Neste vídeo, meu colega Ong Zang demonstrará os procedimentos utilizados para estudar as alterações induzidas pela fagocitose na expressão gênica por meio de uma abordagem de ensaio com repórter baseado em I Luciferase, onde, Olá, sou X do laboratório de Exon North do Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade de Harvard. Hoje eu vou mostrar a vocês como usar um ensaio com gene repórter para analisar a regulação de genes envolvidos na biogênese da membrana após a fagocitose. Então, vamos começar.Para este procedimento, utilizamos culturas de células de rim embrionário humano 293. Essas células são cultivadas em placas de cultura de 10 centímetros em meio A, que consiste no meio de Eagle modificad

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Com o crescente interesse em terapias com células-tronco, técnicas de imagem molecular são ideais para monitorar o comportamento de células-tronco após o transplante. Genes repórter luciferase permitiram não-invasivo de avaliação, repetitiva de sobrevivência da célula, localização e proliferação in vivo. Este vídeo vai demonstrar como controlar a proliferação CTEh em um rato vivo.

In vitro e in vivo de imagens Gene Reporter bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

O vídeo demonstra o ensaio de luciferase usado para quantificar proteínas marcadas com luciferase. O ensaio usa uma enzima luciferase projetada composta por um grande fragmento que se liga ao pequeno fragmento, que é conjugado com uma proteína de interesse. As subunidades ligadas formam uma enzima ativa que, na presença do substrato, libera um sinal luminescente. Este sinal é então quantificado usando um luminômetro.

O ensaio de luciferase: um ensaio de alto rendimento para medir sinais luminescentes usando biorepórteres baseados em sistema de nanoluciferase projetados

Este vídeo demonstra o ensaio de complementação de luciferase dividida para detectar interações proteína-proteína. Neste ensaio, as proteínas de interesse são marcadas em pequenos e grandes fragmentos da enzima luciferase. Quando as proteínas interagem, os fragmentos grandes e pequenos se combinam para formar um complexo enzimático ativo, que na presença de um substrato específico, libera luminescência brilhante que pode ser medida.

Ensaio de complementação de luciferase dividida para identificar interações proteína-proteína específicas

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.

In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

Luciferase geneticamente codificado é um repórter popular não-invasivo da expressão do gene. Uso de um automatizado do longitudinal luciferase gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) de imagem permite gravação longitudinal das células bioluminescentes sob uma ampla gama de condições. Aqui nós mostramos como jacaré pode ser usado no contexto de pesquisa de ritmos circadianos.

Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré)

Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

Os ritmos circadianos, que existem na maioria dos organismos, regulam a organização temporal dos processos biológicos. Os organoides 3D surgiram recentemente como um modelo in vitro fisiologicamente relevante. Este protocolo descreve o uso de repórteres bioluminescentes para observar ritmos circadianos em organoides, possibilitando investigações in vitro de ritmos circadianos em sistemas multicelulares.

Monitoramento de oscilações circadianas com um repórter de bioluminescência em organoides

Aprenda a usar ensaio de luciferase baseado em gene repórter para estudar biogênese de membrana durante fagocitose. Este método analisa regulação gênica pós-fagocitose de partículas.

Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

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