Name: Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Aprenda a usar ensaio de luciferase baseado em gene repórter para estudar biogênese de membrana durante fagocitose. Este método analisa regulação gênica pós-fagocitose de partículas.

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Cultura de células <ol><li> Culturas estoque de rim embrionário humano 293 (HEK293), as células são cultivadas em 10 cm de placas de cultura em &#39;A médio &quot;, consistindo de Medium Modified Dulbecco Águia (DMEM) suplementado com um coquetel de antibióticos (100 unidades por ml de penicilina e 100 mg por ml de sulfato de estreptomicina) e 10% de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Para configurar as células de um experimento, o meio é sugada, e as células são lavadas duas vezes com 5 ml de solução tampão fosfato (PBS). </li><li> O PBS é então removido e substituído por 0,6 ml de uma solução contendo tripsina 0,25%. </li><li> O prato é incubada a 37 ˚ C por cerca de 2 min até que as células começaram a destacar. </li><li> 5,5 ml de meio de A é adicionado para neutralizar o tripsina e as células são contadas com um hemocitômetro. </li><li> Células são diluídos para 320 mil células por ml e dispensados ​​em 0,1 ml por poço em um polilisina revestido de 96 poços placa de cultura. </li><li> Coloque o prato em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ˚ C com uma atmosfera contendo CO2 e crescer 8,8% por 24 hrs. </li></ol> Transfections <ol><li> Na preparação para transfections, deve-se considerar quantas repetições devem ser executadas por condições experimentais e que quantidades de plasmídeo será transfectadas. Nós rotineiramente todas as condições em triplicado e transfecção de um total de 50 a 100 ng de DNA plasmidial por poço. Mistura plasmídeo deve incluir pelo menos um repórter construir expressar firefly luciferase e um controle luciferase Renilla plasmídeo expressando a partir de um promotor constitutivo. </li><li> Soluções plasmídeo são pipetados em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e suplementado com 10 ml por amostra de DMEM sem soro e antibiótico-livre. Por exemplo, se 20 poços estão cada ser transfectadas com 50 mg de DNA, adicionar 200 mL de DMEM 1 mg de DNA. </li><li> Para a solução de DMEM / DNA adicionar 3 mL «Trânsito 293 reagente&quot; (Mirus) por mg de DNA. Mix pipetando cima e para baixo e deixar as amostras em repouso à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. </li><li> Durante este período, remova a mídia da 96 poços placa de cultura e substituir com 90 mL de meio fresco A. </li><li> A cada poço adicionar 10 ml de DMEM / DNA / trânsito 293 mistura. </li><li> Coloque o prato em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ˚ C com uma atmosfera contendo CO2 e crescer 8,8% por 24 hrs. </li></ol> Fagocitose <ol><li> Preparar suspensões contendo B médio (uma mistura 1:1 de DMEM e médias Ham F12 além de antibióticos e 10% FBS) acrescida de 0,75 mícrons esferas de látex em zero a 1 mg por ml. </li><li> Remova a mídia da 96 poços placa de cultura e substituir com 0,1 ml de suspensões talão no meio B. </li><li> Girar a placa de 2 min a 1000 x g. </li><li> As células são cultivadas em seguida, a 37 ˚ C por 6-16 horas. Dependendo das condições eo promotor usado para acionar luciferase, a expressão do gene repórter aumento pode ser detectado após 1 a 3 horas. </li><li> Mesmo em casos pode ser necessário para incubar as células com grânulos de 30 a 60 min, em seguida, fazer duas lavagens com PBS para remover contas sem personalidade jurídica, e adicionar novas mídias antes incubando as células por períodos adicionais de tempo. </li></ol> Dual-GloTM ensaio de luciferase <ol><li> Nota: o nosso protocolo para a utilização deste kit difere em alguns aspectos do que o recomendado pelo fabricante. Ele foi modificado para reduzir a quantidade de reagentes necessários por amostra. </li><li> Prepare uma solução de 1 M DTT, divida em várias pequenas alíquotas e armazenar a -20 ˚ C. </li><li> Preparar um tampão de lise contendo 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) de glicerol, e 0,5% (v / v) de Triton X-100. Antes do uso da alíquota, o montante necessário para a experiência e adicionar 1 ml por ml de 1 M DTT mais coquetel inibidor de protease para uma concentração final de 0,5 a 1x. Não reutilizar os restos de solução de TDT. </li><li> Ao usar o kit Dual-GloTM pela primeira vez, prepare o reagente (vagalume) luciferase, transferindo todo o conteúdo de um frasco de Dual-GloTM buffer luciferase (fornecido com o kit) para uma garrafa de Dual-GloTM substrato luciferase (desde com o kit). Divide o reagente não utilizado luciferase em 10 ml alíquotas e armazenar a -20 ˚ C. </li><li> Remova a placa de 96 poços da cultura de tecidos incubadora e colocá-lo no gelo. Remova a mídia por aspiração, adicionar 40 mL por poço de tampão de lise, e em seguida deixar a placa em gelo por 30 min. </li><li> Em uma branca, opaca de 96 poços da placa (OptiplateTM-96, Perkin Elmer número de catálogo 6005290) alíquota 15 mL por poço de Reagente luciferase, em seguida, adicionar 15 mL de lisado de células. </li><li> Incubar a placa em temperatura ambiente por 10 min e depois ler a luminescência em um leitor de microplacas. </li><li> Imediatamente antes do uso, prepare uma quantidade adequada de solução de substrato Renilla luciferase, adicionando uma parte Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; Reagente (fornecido com o kit) para 100 partes Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (fornecido com o kit). </li><li> A cada poço adicionar 15 mL por poço da solução de substrato Renilla luciferase, incubar em temperatura ambiente por 10 min e depois medir a luminescência novamente. </li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

estudando biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase gene-based reporter

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Para estudar a coordenação de diferentes vias de síntese de lipídios durante a biogênese membrana é útil para trabalhar com um sistema experimental, onde biogénese da membrana ocorre rapidamente e de forma induzida. Descobrimos que a fagocitose de esferas de látex é prático para esses fins como células rapidamente sintetizar lipídios de membrana para reabastecer piscinas membrana perdido como material de acondicionamento durante a imersão de partículas. Aqui, descrevemos os procedimentos para estudar mudanças na fagocitose induzida por expressão de genes com uma abordagem gene luciferase baseado repórter usando o Dual-Glo Sistema de ensaio de luciferase da Promega.

Aqui, descrevemos os procedimentos para estudar mudanças na fagocitose induzida por expressão de genes com uma abordagem gene luciferase baseado repórter usando o Dual-GloTM Sistema de ensaio de luciferase da Promega.

Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

Para estudar a coordenação de diferentes vias de síntese de lipídios durante a biogênese de membranas, é útil trabalhar com um sistema experimental onde a membrana...

Olá, sou IL OV, estudando a coordenação de diferentes vias de síntese de lipídios em relação à memória e à biogênese. É útil contar com um sistema experimental no qual a biogênese de membranas ocorra rapidamente e de forma induzível. Descobrimos que a fagocitose de microesferas de látex é particularmente útil para esses estudos, pois as células sintetizam rapidamente novas membranas para repor aquelas perdidas como material envolvente no início do processo de englobamento.Neste vídeo, meu colega Ong Zang demonstrará os procedimentos utilizados para estudar as alterações induzidas pela fagocitose na expressão gênica por meio de uma abordagem de ensaio com repórter baseado em I Luciferase, onde, Olá, sou X do laboratório de Exon North do Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade de Harvard. Hoje eu vou mostrar a vocês como usar um ensaio com gene repórter para analisar a regulação de genes envolvidos na biogênese da membrana após a fagocitose. Então, vamos começar.Para este procedimento, utilizamos culturas de células de rim embrionário humano 293. Essas células são cultivadas em placas de cultura de 10 centímetros em meio A, que consiste no meio de Eagle modificado por Dulbecco ou DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal ou FBS e um coquetel de antibióticos. Utilizando uma técnica de padronização, as células são destacadas do fundo da placa, contadas e então semeadas em placas de 96 poços revestidas com polilisina, onde são cultivadas por 24 horas até o início das transfeções.Para a nossa transfeção, realizamos rotineiramente todas as condições em triplicata e a transfeção, com um total de 50 a 100 nanogramas de DNA plasmidial por poço. As misturas devem incluir pelo menos o construto repórter que expressa a luciferase de vaga-lume e o plasmídeo controle que expressa a luciferase renal a partir de um promotor constitutivo. Para começar, prepare uma mistura de DMEM sem soro e sem antibiótico com o reagente de transfeção Trans 2 N 3; utilize 10 microlitros de DMEM para cada poço a ser transfectado e 3 microlitros do reagente Trans 2 9 3 por micrograma de DNA plasmidial.Por exemplo, se 20 poços de cada forem transfectados com 50 nanogramas de DNA em três microlitros do reagente trans 2 9 3 para 200 microlitros de DMEM. A solução é misturada pipetando repetidamente para cima e para baixo e, em seguida, deixada em repouso à temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos. Em seguida, o DNA é pipetado em tubos microcentrífugos separados. As concentrações das nossas soluções estoque de DNA geralmente estão entre 10 e 100 nanogramas por microlitro.Após a mistura de trânsito DM M ter incubado por cinco minutos, ela é transferida para o tubo de DNA e a solução é novamente misturada por pipetagem. Em seguida, deixe as amostras em repouso à temperatura ambiente por 20 minutos. Durante a incubação de 20 minutos, remova o meio do placa de cultura de 96 poços e substitua-o por 19 microlitros de meio fresco A assim que a incubação terminar, adicionando 10 microlitros da mistura D-M-M-D-N-A traduzida para três a cada poço.A mistura deve ser pipetada diretamente no líquido existente. Não permita que a ponta da pipeta toque a parede do tubo. Também é importante incluir três poços de células que permanecerão sem inspeção.A atividade média de luciferase nestas placas será posteriormente subtraída como fundo. Coloque a placa de 96 poços no incubador a 37 °C e cultive as células por 24 horas. Após a conclusão da incubação de 24 horas, prosseguimos com a indução da biossíntese de membrana, biossíntese de microesferas lax. Para começar, prepare uma suspensão contendo meio de cultura celular e microesfera lax.Para fazer isso, prepare o meio B, que é uma mistura na proporção de um para um de DM EM e hemps, meio F termo mais antibióticos e 10% de FBS. Em seguida, adicione as microesferas de 0,75 mícron nas concentrações de até um miligrama por mililitro. É claro que cada experimento deve incluir controles nos quais nenhuma microesfera é adicionada.Em seguida, remova o meio da placa de cultura de 96 poços e substitua cada poço por 100 microlitros da suspensão de microesferas. Após a adição da suspensão, centrifugue a placa durante dois minutos a 1000 ×g. Isso ajuda a concentrar as microesferas no fundo do poço e facilita a fagocitose. Em seguida, incube as células a 37 graus C por seis a 16 horas.Dependendo das condições e do promotor utilizado para induzir a luciferase, a expressão gênica do promotor pode ser detectada após uma a três horas. Em certos experimentos, pode ser necessário desacoplar a fal da síntese de lipídios, por exemplo, para estudar os efeitos de certas drogas na síntese de lipídios sem afetar a partícula no governo. Nesses casos, incubar as células com o beat por 30 a 16 minutos para permitir que as células citotizem as microesferas.Após essa incubação, as células são lavadas duas vezes com PBS para remover as microesferas não incorporadas. Em seguida, adiciona-se meio fresco e as células são incubadas por seis a 16 horas para expressão do gene repórter. Agora estamos prontos para prosseguir com os ensaios ferrosos.Para iniciar os ensaios de Lucifer, prepare um tampão xis contendo 20 milimolar de árvores, HCL pH 7,8, 10% volume por volume de glicerol e 0,5% volume por volume de Triton X-100. Antes do uso, adicione a quantidade adequada necessária para o experimento. Em seguida, adicione um microlitro por mililitro de DTT a um molar. Não reutilize a solução de DTT restante.Em seguida, adicione um coquetel de inibidores de protease a uma concentração final de 0,5 a uma vez, ao usar o kit dual glow pela primeira vez, prepare o reagente de luciferase de firefly transferindo todo o conteúdo de um frasco de tampão dual glow luciferase para um frasco de substrato de luciferase dual glow. Divida o reagente de luciferase não utilizado em alíquotas de 10 mililitros e armazene a menos 20 graus C. Uma vez que o reagente de luciferase esteja pronto, remova a placa de 96 poços do incubador de cultura de tecidos e coloque-a sobre gelo. Em seguida, remova o meio por aspiração, depois adicione 40 microlitros por poço de tampão de lise e deixe a placa em gelo por 30 minutos.Em seguida, adicione 15 µL do reagente Lucifer por poço. Em uma placa de 96 poços branca e opaca, utilizamos a placa Perkin S optive 96. Então, adicione 15 µL do lisado celular e incube a placa à temperatura ambiente por 10 minutos.Após 10 minutos, leia a luminiscência em um leitor de microplacas. Em seguida, realize o ensaio de luciferase de baunilha para obter dados para o plasmídeo controle. Para isso, prepare imediatamente antes, utilizando a quantidade apropriada de solução de substrato de luciferase, adicionando uma parte do reagente dual glow, stop and glow a 100 partes.Dual glow, tampão stop and glow. Em seguida, adicione 15 microlitros de solução de substrato a cada poço. Incube a placa em temperatura ambiente por 10 minutos e então meça novamente a luminescência.Observe que modificamos o protocolo recomendado pelo fabricante para esses ensaios luminiscentes duplos ferrosos. A fim de reduzir a quantidade de reagentes necessária para a amostra, agora a placa pode ser analisada novamente usando um leitor de placas. Uma vez que os dados tenham sido coletados com o leitor de microplacas, eles podem ser transferidos para um programa de planilha eletrônica, como o Microsoft Excel, para análise adicional.Primeiro, calcule a média a partir das três poças não ressecadas e subtraia esse valor de cada um dos pontos de dados. Em seguida, divida, para cada poça transfectada, o valor da luciferase de vagalume pela luciferase de *Renilla* e, então, para cada conjunto de amostras em triplicata, calcule a média, o desvio e o coeficiente de variação.No nosso exemplo, utilizamos as diferentes concentrações de microesferas que foram plotadas no eixo x contra a razão entre a atividade de luciferase de firefly e a atividade de luciferase de vanilla. Como você pode ver, há um aumento dependente da dose nesta razão. Acabamos de mostrar como usar um ensaio de gene repórter baseado em luciferase para medir a expressão do promotor do receptor de LDL em resposta à fagocitose de microesferas de látex.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que as células estejam apenas 80 a 90% confluentes no momento da transfeção. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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In vitro e in vivo de imagens Gene Reporter bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

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De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

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In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

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Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

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