Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

Olá, sou IL OV para estudar a coordenação de diferentes vias de síntese lipídica para lembrar e biogênese. É útil ter um sistema experimental onde a biogênese da membrana ocorra rapidamente e induza. Descobrimos que a fagocitose de batimentos de látex é particularmente útil para tais estudos porque as células sintetizam muito rapidamente novas membranas para reabastecer aquelas que foram perdidas como material de embalagem no início do processo de engolfamento.

Neste vídeo, meu colega Ong Zang demonstrará que os procedimentos foram usados para estudar as mudanças induzidas pela fagocitose na expressão gênica usando a abordagem de ensaio de relatório baseada em I Luciferase onde, Olá, sou X da alavancagem do exon North no Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade de Harvard. Hoje vou mostrar como usar um ensaio genético de relatório para analisar a regulação de genes envolvidos na biogênese da membrana após a fagocitose. Então, vamos começar.

Para este procedimento, usamos as culturas de rim embrionário humano 2 93 células. Essas células são cultivadas em placa de cultura de 10 centímetros em meio A, que consiste nos fardos modificados águias egos meio ou DMM suplementado com 10% de soro fetal B ou FBS e um coquetel de antibióticos. Usando uma técnica de padronização, as células são destacadas do fundo do prato, contrariadas e, em seguida, revestidas com polilisina nas placas de 96 poços, onde são cultivadas por 24 horas até o início das transações.

Para o nosso transfecto, realizamos rotineiramente todas as condições em triplicata e transfecto, um total de 50 a 100 e nanogramas de DNA plasmidial por poço. As misturas xadrez devem incluir pelo menos a construção repórter que expressa a luciferase do vaga-lume e o plasmídeo de controle que expressa os lúciferes renais de um promotor constitutivo. Para começar, prepare uma mistura de quadro de soro e quadro antibiótico DM EM com trans dois N três reagentes de transfecção use 10 microlitros de DMM para cada poço a ser transfectado e a três microlitros de trans 2 9 3 reagente por micrograma de DNA plasmidial.

Por exemplo, se 20 poços de cada um forem transfectados com 50 nanogramas de DNA a três microlitros de reagente trans 2 9 3 para 200 microlitros de DM EM. A solução é misturada pipetando repetidamente para cima e para baixo e, em seguida, deixada sem perturbações à temperatura ambiente durante pelo menos cinco minutos. Em seguida, o DNA é pipeado em tubos de microcentrífuga separados. As concentrações de nossas soluções de estoque de medidor positivo são geralmente entre 10 e 100 nanogramas por microlitro.

Uma vez incubada a mistura de trânsito DM M durante cinco minutos, é transferida para o tubo de ADN e a solução é novamente misturada por pipetagem. Em seguida, deixa as amostras repousarem à temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante a intubação de 20 minutos, remova o meio da placa de cultura de 96 teias e substitua-o por 19 microlitros de meio fresco A assim que a incubação estiver completa nos 10 microlitros do DMDNA traduza em três misturas para cada poço.

A mistura deve ser pipetada diretamente no líquido existente. Não deixe a ponta da pipeta tocar na parede do tubo. Também é importante incluir três poços de células que serão deixados inspeccionados.

A atividade média da luciferase nesses poços será posteriormente subtraída à medida que o fundo coloca a placa de 96 poços na incubadora de 37 graus C e cultiva as células por 24 horas. Uma vez concluída a incubação de 24 horas, prosseguimos com a indução da biossíntese da membrana, biose de grânulos frouxos. Para começar, prepare uma suspensão contendo meio de cultura de células e grânulo frouxo.

Para fazer isso, prepare o meio B, que é uma mistura de um para um de DM EM e cânhamo, meio termo F mais antibióticos e 10% FBS. Em seguida, nas contas frouxas de 0,75 mícron nas concentrações de até um miligrama por mililitro. Claro, todo experimento deve incluir controles onde não são adicionadas contas.

Em seguida, remova a mídia da placa de cultura de 96 poços e substitua cada poço pelos 100 microlitros da suspensão do cordão. Uma vez adicionada a suspensão, gire a placa por dois minutos a 1000 G. Isso ajuda a concentrar o cordão no fundo do poço e facilita a fagocitose. Em seguida, capture as células a 37 graus C por seis a 16 horas.

Dependendo das condições e do promotor usado para conduzir o aumento da luciferase, a expressão gênica do promotor pode ser detectada após uma a três horas. Para certos experimentos, pode ser necessário desacoplar o fal da síntese lipídica, por exemplo, para estudar os efeitos de certas drogas na síntese lipídica sem afetar a partícula no governo. Nesses casos, incube as células com a batida por 30 a 16 minutos para permitir que as células citem as contas.

Após essa incubação, as células são lavadas duas vezes com o PBS para remover as esferas não incorporadas. Em seguida, novos meios são adicionados e, em seguida, as células são incubadas por seis a 16 horas para relatar a expressão gênica. Agora estamos prontos para prosseguir com os ensaios ferosos.

Para iniciar os ensaios de Lúcifer, prepare um tampão xis contendo 20 milhões de árvores molares, HCL pH H 7,8 10% volume a volume de glicerol e 0,5% volume a volume triton X 100 antes de usar a quantidade adequada necessária para o experimento. Em seguida, a um microlitro por mililitro de um molar DTT. Não reutilize a solução DT T restante.

Em seguida, em um coquetel de inibidor de protease para uma concentração final de 0,5 a uma vez ao usar o kit de brilho duplo pela primeira vez, prepare o reagente de lúciferes de vaga-lume transferindo todo o conteúdo de um frasco de tampão de lúciferes de brilho duplo para um frasco de substrato de luciferase de brilho duplo. Divida o reagente de luciferase não utilizado em quas de 10 milímetros e armazene a menos 20 graus C. Quando o reagente de luciferase estiver pronto, remova a placa de 96 poços da incubadora de cultura de tecidos e coloque-a no gelo. Em seguida, remova o medial por aspiração, adicione os 40 microlitros por poço de tampão de lise e deixe a placa no gelo por 30 minutos.

Em seguida, qua 15 microlitros de reagente de Lúcifer por poço. Em uma placa branca opaca de 96 poços, usamos a placa óptica Perkin S 96. Em seguida, no 15 microlitro de célula comeu e incubou a placa em temperatura ambiente por 10 minutos.

Após 10 minutos, leia a luminescência em um leitor de microplacas. Em seguida, execute o ensaio de lúciferes de baunilha para somar dados para o plasmídeo de controle. Para fazer isso, prepare-se imediatamente antes de usar a quantidade apropriada de solução de substrato de luciferase adicionando uma parte de reagente de brilho duplo, parada e brilho a 100 partes.

Dual glow, stop e glow buffer. Em seguida, adicione 15 microlitros de solução de substrato a cada um. Bem, incube a placa em temperatura ambiente por 10 minutos e depois meça a luminescência novamente.

Observe que modificamos o protocolo recomendado pelo fabricante para esses ensaios ferosos de brilho duplo. Para reduzir a quantidade de reagentes necessários para a amostra profissional, agora a placa pode ser analisada novamente usando um leitor de placas. Uma vez que os dados tenham sido coletados com o leitor de microplacas, eles podem ser transferidos para um programa de planilha como o Microsoft Excel para análise posterior.

Primeiro, calcule a média dos três poços não ressecados e subtraia esse valor de cada um dos pontos de dados. Em seguida, divida para cada poço transfectado o valor da luciferase do vaga-lume. Compre isso para luciferase e calcule para cada conjunto de amostras triplicadas, calcule a média e, em seguida, o desvio e o coeficiente de variação.

Em nosso exemplo, usamos as diferentes concentrações de contas que foram plotadas no eixo x em relação à proporção de vaga-lume sobre a atividade de lucro de baunilha. Como você pode ver, há um aumento dependente da dose nessa proporção. Acabamos de mostrar como usar um relatório baseado em lúciferes, ensaio genético para medir a expressão do promotor do receptor LDL em resposta à fagocitose de velocidades de látex.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de ter certeza de que as células são apenas 80 a 90% confluentes no tempo de transfecção. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.