Name: Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a técnica de patch-clamp em oócitos de Xenopus laevis para estudar canais iônicos. Este método demonstra a remoção da membrana vitelina, formação de selo gigaohm e configuração outside-out para pesquisa eletrofisiológica.

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Receita encolher solução é a partir do laboratório de RW Aldrich. Agradecemos aos seguintes agências de fomento e fundações de apoio: National Institutes of Health, National Science Foundation, a American Heart Association, Associação de Distrofia Muscular, o B. Donald e Delia E. Baxter Foundation, o Fundo Klingenstein e da Fundação McKnight for Neuroscience.

Parte 1: Remover a membrana vitelina <ol><li> Prepare dois conjuntos de fórceps. Nós preferimos No. 5 fórceps, onde um conjunto foi ligeiramente afiada com uma lima. Também preparar uma pipeta de vidro por corte e polimento-fogo de 7 &quot;Pasteur pipeta. </li><li> Recomendações: Para evitar que os oócitos de escorregar, corte um círculo de grade (1 praças mm) e cola na parte inferior de uma placa de Petri 60mm. Este prato pode ser reutilizado indefinidamente se mantidos limpos entre os usos. </li><li> Encha o prato de Petri até a metade com solução hiperosmótico (ver receita) e colocar sob um microscópio de dissecação. </li><li> Remover oócitos 03/01 Xenopus da sua solução de incubação com uma pipeta Pasteur polido e coloque no prato. </li><li> Aguarde 15s - 2 min para que as células começam a encolher. Vezes mais fazer as células mais fáceis de descascar, tempos mais curtos para as células saudáveis ​​para remendar. </li><li> Com a redução da célula, a membrana vitelina começará a tornar-se visível apenas como uma camada transparente sobre a célula. Selecione uma célula saudável (sem voltas ou defeitos) para peeling. </li><li> Com um par de fórceps, gentilmente compreender a membrana vitelina sem danificar a membrana plasmática. Com a outra, segure perto do mesmo local e gentilmente rasgar a membrana transparente e livre para além da célula. </li><li> Com a pipeta de Pasteur, cuidadosamente mover a célula para a câmara de gravação. Note-se que a célula será frágil após a remoção vitelínico. </li></ol> Parte 2: geração Gigaseal <ol><li> Preencha uma pipeta de gravação com solução salina. Use o volume mínimo de solução que faz um bom contato elétrico com o fio de eletrodo de modo a minimizar a capacitância pipeta. </li><li> Flick os tempos de pipeta para permitir que várias bolhas a flutuar e deslizar no fio do eletrodo. Aplicar pressão para a pipeta cheia. Isto pode ser feito por via oral ou com uma bomba de aquário de uma loja de animais. Esta pressão é fundamental para manter a pipeta limpa, uma vez que atravessa a interface líquido e se move para a célula. </li><li> Encontrar o óvulo na câmara e focar fortemente na borda da célula. </li><li> Com a pipeta de sair do banho, o centro da ponta (fora de foco) acima da célula. Desta vez, minimiza gasto no banho antes da geração do selo. </li><li> Queda da pipeta para baixo em foco ao lado do celular. Trazê-lo em estreita proximidade (~ 50 microns). Você deverá ver uma pequena distorção de solução empurrado para fora da pipeta pela pressão de volta. </li><li> Usando o software patch clamp, verifique a resistência da pipeta (nossa meta é de aproximadamente 3-4 mohms) e zerar o atual usando a tensão de offset. </li><li> Com uma pressão positiva sobre a pipeta, mova a ponta lentamente em direção ao celular enquanto monitoramento da resistência visualmente ou utilizando um monitor de áudio que gera um tom cuja freqüência é proporcional à resistência. Como a ponta começa a tocar o celular, a resistência vai aumentar. </li><li> De repente, mas com cuidado mudar de positivo para a pressão negativa de aproximadamente o mesmo valor absoluto. Resistência deve aumentar para selar formação. </li><li> A maior parte do tempo, a formação de vedação ocorre dentro de alguns segundos, ocasionalmente 30-60 segundos são necessários. </li><li> Uma vez que a resistência está em 1GΩ, a pressão pode ser liberado para neutro. Você agora tem um patch on-celular. Para um patch de dentro para fora, afastar a célula rapidamente. Para fora-out, veja abaixo. </li></ol> Parte 5: Fora-out topologia (opcional) <ol><li> Imediatamente após atingir uma ruptura, gigaseal da membrana. Isto pode ser feito com sucção forte, mas nós preferimos a 1 V de pulso para 1 ms. A resistência deve cair para pouco mais do que a resistência inicial da pipeta. </li><li> Mover a pipeta fora da célula lenta e suavemente. Você deverá ver uma parte da célula com o puxar da pipeta. De repente, e dentro de alguns segundos, o celular vai pular de volta ea resistência deve imediatamente e, simultaneamente, voltar ao GΩs. </li><li> Você agora tem um patch na configuração fora-out. Ectodomínios de qualquer canais iônicos incluído é exposta ao banho. </li></ol> Parte 6: Resultados Previstos Geralmente, os focas maior resistência são preferíveis e mais vivido. 10 GÊ é uma boa orientação de alta qualidade selos. Em nossa experiência, as chances de selos desta qualidade variam de acordo com muitos fatores, especialmente celular e pipeta de qualidade. Taxas de aquisição patch pode ser mais de 95% com as células saudáveis, pipetas limpas, e um investigador experiente. Essas manchas podem durar muitos minutos e são adequados para qualquer estudo eletrofisiológico de canais iônicos expressos em oócitos Xenopus, incluindo um único canal de gravações.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Há muitos parâmetros de gravação eletrofisiológico não serão discutidos aqui. Configuração de equipamento, sistema de gestão de ruído, expressão de canais e protocolos de gravação são também essenciais para bons resultados experimentais. Em nossa experiência, estes são os parâmetros mais críticos para a formação de selos de confiança: oócitos de alta qualidade, a remoção da membrana vitelina rapidamente (aka, &quot;peeling&quot;), use pipetas recém puxado protegido de poeira, pipetas suave, a pressão positiva aplicada ao entrar no b...

<table><tbody><tr><td>Amplificador de Grampo por Eletrodo de Micropipeta &amp;& Software</td><td>Instrumento</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>Ou outro dispositivo semelhante (por exemplo, HEKA EPC-9 ou Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>Pinça número 5 (dois pares)</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução para encolhimento de ovócitos</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Ingrediente Em mMN-metil-D-glucamina 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Ácido aspártico 220KCl 2pH ajustado para 7,4 com N-metil-D-glucamina</td></tr><tr><td>malha tecida</td><td>800 µm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

gravação de patch-clamp de canais iônicos expresso em oócitos xenopus

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Desde o seu desenvolvimento por Sakmann e Neher 1, 2, o patch clamp se estabeleceu como uma técnica extremamente úteis para a aferição eletrofisiológica de canais de iões simples ou múltiplas nas células. Esta técnica pode ser aplicada a canais iônicos tanto no ambiente de sua nativa e expresso em células heterólogas, como oócitos colhidos o sapo com garras Africano, Xenopus laevis. Aqui, descrevemos a técnica bem estabelecida de gravação de patch-clamp de oócitos Xenopus. Esta técnica é utilizada para medir as propriedades de canais iônicos, expressos quer em populações (macropatch) ou individualmente (single-channel de gravação). Nós nos concentramos em técnicas para maximizar a qualidade da preparação de oócitos e geração de selo. Com todos os fatores otimizados, esta técnica dá uma probabilidade de geração de selo de sucesso mais de 90 por cento. O processo pode ser otimizado de forma diferente por cada pesquisador com base nos fatores que ele ou ela acha mais importante, e nós apresentamos a abordagem que levaram à maior sucesso em nossas mãos.

Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Desde o seu desenvolvimento por Sakmann e Neher 1, 2, o patch clamp estabeleceu-se como uma técnica extremamente útil para a eletrofisiologia...

Este procedimento começa com a remoção da membrana vilina de Opus Cytes, a fim de formar com sucesso os selos resistentes de gigaohm necessários para gravações de patch clamp. Uma vez obtida a configuração de patch clamp em célula intacta, pode-se aplicar sucção à pipeta para obter acesso elétrico ao citoplasma da célula, o que é conhecido como configuração de patch de célula inteira. Em seguida, a ponta da pipeta pode ser puxada para longe da membrana plasmática até que ela se rompa, a fim de obter um pequeno fragmento de membrana no qual os domínios ecto dos canais ficam expostos à solução do banho; isso é conhecido como configuração de patch fora-da-célula. Olá, eu sou Austin Brown do laboratório da Dra. Miriam Goodman do Departamento de Fisiologia Molecular e Celular da Universidade de Stanford.E eu sou Brandon Johnson, também do Laboratório Goodman. Em um vídeo anterior, demonstramos como fabricar pipetas para grampo de membrana e eletrodos afiados para eletrofisiologia. Hoje apresentaremos uma introdução ao registro por grampo de membrana de canais iônicos expressos em zpa.Desde o seu desenvolvimento por S. Sacramento e Air no final da década de 1970, o registro por patch cla

patch-clamp-recording-of-ion-channels-expressed-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos...

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

Descrevemos um método para quantificar a atividade de ATPases do tipo P de contratransporte de K+ pela expressão heteróloga das enzimas em oócitos de Xenopus e medindo a captação de Rb+ ou Li+ em células individuais por espectrofotometria de absorção atômica. O método é uma alternativa sensível e segura aos experimentos de fluxo de radioisótopos, facilitando estudos cinéticos complexos.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

A abordagem lacuna vaselina cut-aberto é usado para obter baixos gravações de ruídos de correntes iônicas e gating de canais iônicos dependentes de voltagem expressos em oócitos de Xenopus com alta resolução de cinética de canais rápidos. Com modificações menores, fixador de tensão fluorometria pode ser acoplado com o protocolo do oócito corte aberto.

O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

Aqui apresentamos um protocolo para expressar proteínas de junção de lacunas em oócitos xenopus e gravar corrente juncional entre dois oócitos apposed usando um amplificador comercial projetado para gravações de tensão de oócito duplo em um modo de medição de corrente lateral alta.

Gravação gap junction current de Xenopus Oocytes

Métodos para Recordings patch-clamp Capacitância da Calyx

Aprenda a técnica de patch-clamp em oócitos de Xenopus laevis para estudar canais iônicos. Este método demonstra a remoção da membrana vitelina, formação de selo gigaohm e configuração outside-out para pesquisa eletrofisiológica.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

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