Tornando-Patch pipetas e Eletrodos Sharp com um extrator programável

As pipetas capilares de vidro tornaram-se onipresentes em laboratórios para uma ampla variedade de técnicas, como eletroporação de célula única, microinjeção de DNA e eletrofisiologia de patch clamp Para preparar eletrodos de grampo capilar de vidro para gravações ou vidro de silicato é puxado em um polar programável. As pontas dos eletrodos são revestidas com cera e, em seguida, as pontas são polidas a fogo e armazenadas para uso futuro. Olá, sou Miriam Goodman, do Departamento de Fisiologia Molecular e Celular da Universidade de Stanford.

Neste vídeo, demonstrarei como fazer pipetas de patch clamp e eletrodos afiados para eletrofisiologia. Os microeletrodos de vidro, também chamados de pipetas, têm sido um cavalo de batalha da eletrofisiologia há décadas. Hoje, essas pipetas são feitas de capilares de vidro usando uma tração programável.

Então vamos começar. Para fazer pipetas de patch clamp, usamos seda de javali Sutter em capilares limpos e livres de poeira, e usamos o extrator de microeletrodo de solo flamejante Sutter P nine seven. O Sutter's Pipette Cookbook é uma excelente referência para o desenvolvimento de programas de tração adequados.

Para começar, levante a tampa contra poeira do extrator. Em seguida, pegue um tubo capilar de vidro da caixa. Certifique-se de recolocar a tampa para minimizar o acúmulo de poeira.

Em seguida, com uma mão, deslize o capilar na ranhura de um lado do filamento, aperte levemente o grampo. Neste ponto, o grampo deve estar apertado o suficiente para evitar que o tubo caia, mas solto o suficiente para que você possa deslizá-lo para dentro da ranhura. Agora, solte o batente de metal da mola do mesmo lado.

Em seguida, com o polegar e o indicador, segure as abas de metal presas à parte inferior de ambos os transportadores. Solte o outro batente de metal da mola. Puxe os transportadores o máximo possível e segure no lugar com uma mão.

Em seguida, deslize o tubo através do invólucro do filamento na ranhura do suporte do outro lado. Evite empurrar o vidro para dentro do filamento de aquecimento. Aperte os grampos em ambos os lados.

Eles devem ser apertados o suficiente para manter os transportadores no lugar, mas não tão apertados que o vidro seja esmagado. Agora, feche a tampa contra poeira e pressione o botão verde. Pipetas de pólo marcadas para gravações de grampos de remendo são formadas usando um programa de pesquisa de cinco etapas com calor e velocidade decrescentes em cada etapa e um pequeno poste na etapa final.

Este programa usa calor e gravidade. O procedimento para fazer eletrodos afiados é muito semelhante, mas, neste caso, usamos o capilar de vidro fino da Warner Instruments que tem um diâmetro externo de um milímetro e um diâmetro interno de 0,78 milímetros. Também aplicamos um programa de tração que usa um motor além de calor e gravidade quando os programas de tração são concluídos.

Levante a tampa contra poeira, afrouxe os dois clamps e remova a pipeta acabada. Em seguida, coloque as pipetas em uma caixa de trabalho. A caixa pode ser feita colando uma tira de espuma no rack de uma caixa de ponta de pipeta de plástico e, em seguida, cortando de seis a oito fendas na espuma.

Insira as pipetas nas fendas. Quando a caixa estiver cheia de pipetas puxadas, prossiga para a etapa de polimento a fogo para polir as pipetas. Configure um equipamento de micro forja com um filamento de aquecimento de platina controlado por um pedal antes de iniciar o polimento a fogo.

Primeiro cubra a pipeta com cera dental para diminuir a capacitância e melhorar as características de ruído. Para fazer isso, mantenha um pequeno suprimento de cera derretida por perto. Aplique pressão de ar na parte de trás da pipeta para evitar que a cera entre na ponta.

Em seguida, mergulhe a ponta brevemente na cera líquida. E remova agora. Coloque a pipeta no aparelho de polimento e afaste a ponta aproximadamente 50 mícrons do filamento.

Lembre-se de que o filamento se expandirá quando aquecido. Aplique um breve pulso de calor de um ou dois segundos para remover a cera da ponta da pipeta e alisar o vidro. Examine as pontas da pipeta ao microscópio para determinar o diâmetro e a suavidade da abertura.

Para gravações padrão de patch clamp, as aberturas da ponta devem ter de um a três mícrons de diâmetro, descarte, pontas ásperas, irregulares ou irregulares. Coloque a pipeta pronta em uma caixa de trabalho, certificando-se de fechar a tampa para proteger as pipetas da repetição de poeira para 10 pipetas bem-sucedidas. Acabei de mostrar como fazer pipetas de patch clamp e eletros afiados usando um extrator programável.

O mesmo procedimento pode ser usado para fazer uma variedade de ferramentas de vidro, incluindo agulhas de injeção para resultados ideais de patch clamp. É importante lembrar de retirar novas pipetas sem poeira no mesmo dia do experimento e poli-las dentro de uma hora após o experimento. Verifique também por inspeção se as pipetas estão lisas e polidas.

Não deixe de assistir ao nosso outro vídeo, que demonstra como realizar a gravação de patch clamp de canais iônicos expressos em oócitos opus. Ok, é isso. Agora você é um especialista em pipetas e boa sorte com seus experimentos.