Name: Tornando-Patch pipetas e Eletrodos Sharp com um extrator programável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprenda a fabricar pipetas de patch clamp e eletrodos agudos para eletrofisiologia usando um extrator programável. Este método demonstra técnicas essenciais de preparação de vidro para pesquisa em neurociência.

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Agradecemos aos seguintes agências de fomento e fundações de apoio: National Institutes of Health, National Science Foundation, a American Heart Association, Associação de Distrofia Muscular, o B. Donald e Delia E. Baxter Foundation, o Fundo Klingenstein e da Fundação McKnight for Neuroscience.

Pipetas puxando Utilizando um extrator de microeletrodos como o Sutter P-97 Flaming / Brown, puxe um conjunto de aproximadamente 10-20 pipetas. <ol><li> Selecione seu vidro capilar. Usamos borosilicato capilares (Sutter BF150-110-10, diâmetro externo 1,5 mm, diâmetro interno 1,1 milímetros, 10 centímetros de comprimento). Armazenar o vidro com cuidado para que ele permaneça limpo e livre de poeira. </li><li> Conceber um programa de puxar. Usamos um programa passo 5, com o calor descendente e velocidade a cada passo, e um pequeno empuxo na etapa final. Cookbook Sutter pipeta é uma excelente referência para o desenvolvimento de programas adequados. </li><li> Examine as pontas de pipeta sob um microscópio para determinar o diâmetro de abertura e suavidade. Descartar áspera, dicas irregular, ou irregular. Um bom protocolo puxando deve garantir estes são raros. Para a gravação de patch-clamp padrão, aberturas de ponta deve ser mícrons de diâmetro 1-3. A cônico (blunt ponta) leva a menor resistência para o diâmetro de abertura mesmo. Forma e tamanho pode ser modificado pelo polimento pressão. </li></ol> Polimento pipetas fogo <ol><li> Criar uma plataforma de polimento (microforge) com um filamento de platina de aquecimento controlado por um pedal. Um kit útil está disponível a partir ALA Científica (CPM-2) ou um aparelho semelhante pode ser montado aos poucos. </li><li> Opcional: Brasão da pipeta com um isolante para diminuir a capacitância e melhorar as características de ruído. Usamos cera dental. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil elastômero de siloxano também conhecido como PDMS) também é uma opção. </li><li> Se usar a cera, mantenha um pequeno estoque de fundição nas proximidades. Com pressão de ar na parte traseira da pipeta para manter cera de entrar na pipeta, mergulhe a ponta brevemente para a cera líquida e remover. Com Sylgard, armazenar elastômero preparado congelado em alíquotas e pintar a ponta da pipeta sob um microscópio. Calor para a cura do elastômero. </li><li> Coloque a pipeta (revestidos ou não) no aparelho de polimento e trazer a ponta a 50 microns do filamento. Tenha em mente que o filamento se expande quando aquecida. </li><li> Recomendações: Siga o protocolo separado para &quot;polir pressão&quot; para alterar a forma da pipeta para ótima resistência e diâmetro da ponta. </li><li> Um pulso de calor breve (1-2 segundos) é suficiente para remover a cera da ponta da pipeta e suave do vidro. </li><li> Coloque a pipeta terminou em uma caixa fechada para proteger da poeira, repita por 10 pipetas de sucesso. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

O protocolo aqui é ilustrado no uso diário em eletrofisiologia laboratórios e também é usado para fazer agulhas de injeção de células e animais. Com um extrator programáveis, é fácil de fazer pipetas para uma variedade de usos. Com atenção e cuidado, o filamento em seu puxador vai durar um ano ou mais. Boa sorte com suas experiências.

<table><tbody><tr><td>Puxador de micropipetas</td><td>Instrumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Ou instrumento semelhante (por exemplo, Sutter P-87 ou P-2000)</td></tr><tr><td>Capilares de vidro</td><td>Reagente</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>Ou capilar de vidro semelhante. Para facilitar o preenchimento da pipeta, utilize um capilar com filamento de vidro.</td></tr></tbody></table>

tornando-patch pipetas e eletrodos sharp com um extrator programável

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Microeletrodos de vidro (também chamado de pipetas) ter sido um cavalo de batalha da eletrofisiologia por décadas. Hoje, pipetas, tais são feitas de vidro capilares usando um extrator programável. Calor tais instrumentos do capilar usando um filamento de metal ou de um laser e tirar o vidro usando a gravidade, um motor ou ambos. Pipetas para patch-clamp de gravação são formadas utilizando apenas o calor ea gravidade, enquanto eletrodos afiados para a gravação intracelular usar uma combinação de calor, gravidade, e um motor. O procedimento usado para fazer gravação de pipetas intracelular é semelhante ao usado para fazer agulhas de injeção para uma variedade de aplicações, incluindo cRNA injeção em oócitos Xenopus. Em vidro, em geral capilar &lt;1,2 mm de diâmetro é usado para fazer pipetas para gravação de patch clamp, enquanto estreito de vidro é usado para a gravação intracelular (diâmetro externo = 1,0 mm). Para cada ferramenta, o extrator é programado de forma ligeiramente diferente. Este vídeo mostra como fazer os dois tipos de pipetas de gravação usando programas pré-estabelecidos extrator.

Este vídeo mostra como usar um extrator programáveis ​​para fazer pipetas patch e eletrodos afiada para eletrofisiologia. O mesmo procedimento pode ser usado para fazer uma variedade de ferramentas de vidro, inclusive agulhas de injeção.

Tornando-Patch pipetas e Eletrodos Sharp com um extrator programável

Microeletrodos de vidro (também chamados de pipetas) têm sido fundamentais para a eletrofisiologia durante décadas. Atualmente, tais pipetas são fabricadas a partir de capilares de vidro...

As pipetas capilares de vidro tornaram-se onipresentes em laboratórios para uma grande variedade de técnicas, como eletroporação em célula única, microinjeção de DNA e eletrofisiologia com eletrodo de patch clamp. Para preparar eletrodos de vidro capilares para gravações com patch clamp, o vidro de silicato é puxado em um puxador programável. As pontas dos eletrodos são revestidas com cera, e então as pontas são polidas com chama e armazenadas para uso futuro. Olá, sou Miriam Goodman do Departamento de Fisiologia Molecular e Celular da Universidade de Stanford.Neste vídeo, demonstrarei como fabricar pipetas para grampo de membrana e eletrodos afiados para eletrofisiologia. Os microeletrodos de vidro, também chamados de pipetas, são amplamente utilizados na eletrofisiologia há décadas. Atualmente, essas pipetas são produzidas a partir de capilares de vidro utilizando um puxador programável.Então vamos começar. Para fabricar pipetas para o registro em configuração de patch clamp, utilizamos capilares de vidro borossilicato Sutter limpos e livres de poeira, e empregamos o puxador de microeletrodos com chama Sutter P97. O Pipette Cookbook da Sutter é uma excelente referência para desenvolver programas adequados de puxamento.Para começar, levante a tampa protetora do puxador. Em seguida, pegue um tubo capilar de vidro da caixa. Certifique-se de recolocar a tampa para minimizar o acúmulo de poeira.Em seguida, com uma mão, deslize o capilar para o sulco em um dos lados do filamento e aperte levemente o prendedor. Neste momento, o prendedor deve estar suficientemente apertado para impedir que o tubo caia, mas ainda solto o bastante para permitir que seja deslizado para dentro do sulco. Agora, solte o travamento de metal com mola no mesmo lado.Em seguida, com o polegar e o indicador, segure as abas metálicas que estão presas à parte inferior de ambos os suportes. Solte o outro travamento de metal com mola. Puxe os suportes o máximo possível um em direção ao outro e mantenha-os fixos com uma das mãos.Em seguida, deslize o tubo através do alojamento do filamento até o entalhe do suporte no outro lado. Evite empurrar o vidro contra o filamento de aquecimento. Aperte as braçadeiras em ambos os lados.Eles devem ser suficientemente apertados para manter os porta-objetos no lugar, mas não tão apertados a ponto de quebrar o vidro. Agora, feche a tampa contra poeira e pressione o botão verde. Pipetas com ponta afilada para gravações de patch clamp são fabricadas utilizando um programa de puxamento em cinco etapas, com calor e velocidade decrescentes em cada etapa e uma pequena ponta na etapa final.Este programa utiliza calor e gravidade. O procedimento para fabricar eletrodos finos é muito semelhante, mas, neste caso, usamos o capilar de vidro fino da Warner Instruments, que possui um diâmetro externo de um milímetro e um diâmetro interno de 0,78 milímetros. Também aplicamos um programa de tração que utiliza um motor, além de calor e gravidade, quando os programas de tração são finalizados.Levante a tampa protetora, solte ambas as braçadeiras e remova a pipeta acabada. Em seguida, coloque as pipetas em uma caixa de trabalho. A caixa pode ser feita colando uma tira de espuma no suporte de uma caixa plástica de ponteiras para pipeta e, depois, cortando de seis a oito fendas na espuma.Insira as pipetas nas fendas. Quando a caixa estiver cheia de pipetas puxadas, prossiga para a etapa de polimento a fogo para polir as pipetas. Monte um equipamento de micro-fornalha com um filamento de aquecimento de platina controlado por um pedal antes de iniciar o polimento a fogo.Primeiro, revista a pipeta com cera dental para reduzir a capacitância e melhorar as características de ruído. Para isso, mantenha uma pequena quantidade de cera fundida por perto. Aplique pressão de ar na parte traseira da pipeta para impedir que a cera entre na ponta.Em seguida, mergulhe brevemente a ponta na cera líquida. E retire agora. Coloque a pipeta no aparelho de polimento e posicione a ponta a aproximadamente 50 micrômetros do filamento.Leve em consideração que o filamento se expandirá quando aquecido. Aplique um breve pulso de calor de um ou dois segundos para remover a cera da ponta da pipeta e suavizar o vidro. Examine as pontas das pipetas ao microscópio para determinar o diâmetro da abertura e a suavidade.Para gravações padrão de patch clamp, as aberturas das pontas devem ter de um a três mícrons de diâmetro; descarte pontas ásperas, irregulares ou não uniformes. Coloque a pipeta pronta em uma caixa de trabalho, certificando-se de fechar a tampa para proteger as pipetas contra poeira; repita o procedimento para 10 pipetas bem-sucedidas. Acabei de mostrar como fabricar pipetas para patch clamp e eletrodos afiados utilizando um puxador programável.O mesmo procedimento pode ser usado para fabricar uma variedade de ferramentas de vidro, incluindo agulhas de injeção para resultados ideais de patch clamp. É importante lembrar de puxar novas pipetas livres de poeira no mesmo dia do experimento e poli-las dentro de uma hora antes do experimento. Verifique também, por inspeção visual, se as pipetas estão lisas e polidas.Certifique-se de assistir ao nosso outro vídeo, que demonstra como realizar o registro de clamp de patch de canais iônicos expressos em oócitos de opus. Ok, é isso. Agora você é um especialista em pipetas e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

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