Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Este procedimento começa posicionando a ponta da pipeta perto do filamento de polimento com ampliação de 100 vezes. Em seguida, ligue a pressão do ar e o calor. O filamento.

A ponta da pipeta se expandirá para formar uma ponta romba. Desligue o fogo para obter uma abertura de ponta menor. Desligue a pressão e aqueça novamente.

Olá, sou Brandon Johnson, do laboratório da Dra. Miriam Goodman no Departamento de Fisiologia Molecular e Celular da Universidade de Stanford. Hoje mostraremos um procedimento para polir pipetas de remendo por pressão. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar canais iônicos e adesivos de membrana e neurônios NC elgan.

Então vamos começar. Puxe um conjunto de seis a 10 pipetas de remendo. Consulte um especialista local ou nosso experimento visualizado fazendo pipetas de patch e eletrodos afiados com um polar programável para obter ajuda.

Para iniciar o procedimento, defina uma pressão de linha de ar comprimida para cerca de 40 PS. Em seguida, conecto a linha de ar comprimida a uma válvula de controle de quatro vias. Conecte um pedaço de tubo de plástico à válvula de quatro vias e conecte um suporte de pipeta de alta pressão à extremidade solta do tubo de plástico. Use um equipamento de micro forja para realizar o polimento.

Usamos o kit Ccpm two de uma LA Scientific. Este equipamento tem um suporte de pipeta de alta pressão, um filamento de aquecimento de platina controlado por um pedal e um microscópio equipado com uma ampliação baixa e alta de 10 vezes em 100 vezes de comprimento. As objetivas de ar de distância de trabalho são ideais porque é fundamental poder observar a abertura da pipeta durante o protocolo.

Em seguida, verifique se a válvula de pressão está na posição desligada. Em seguida, coloque uma pipeta no porta-pipetas e aperte a conexão com os dedos para a segurança do laboratório. Certifique-se de que a pipeta esteja firmemente presa no porta-pipeta.

Caso contrário, a pressão do ar fará com que a pipeta seja ejetada do suporte. Como etapa opcional, você pode revestir a pipeta com um isolante hidrofóbico, como cera, para diminuir a capacitância e melhorar as características de ruído. Agora coloque a pipeta no suporte na microforja, posicione o suporte da pipeta no microscópio stage, de modo que a ponta e o filamento de polimento fiquem visíveis a uma potência baixa de 10 vezes na microforja.

Traga a ponta aproximadamente 50 mícrons do filamento e, em seguida, mude para a objetiva 100 de alta potência, tanto a ponta da pipeta quanto o filamento de polimento devem estar em foco e no campo de visão. Caso contrário, ajuste a altura do filamento. Como a posição da pipeta não pode ser ajustada, a ponta da pipeta e o filamento devem estar em lados opostos do campo de view.

Evite posicionar a ponta da pipeta muito perto do filamento, pois ela se expandirá à medida que aquece e pode esbarrar na pipeta. Uma vez que a ponta e o filamento estejam posicionados corretamente, gire a válvula para direcionar o ar pressurizado para dentro da pipeta e aqueça a ponta da pipeta até que o cone atrás da ponta comece a inchar para fora. Pare o aquecimento antes que a ponta inche muito.

A experimentação é necessária para determinar a distância, o calor e o tempo apropriados para a forma desejada. Como etapa opcional, você também pode polir a ponta na ausência de pressão para reduzir o diâmetro de abertura da ponta. Além disso, lembre-se de que essas etapas de polimento podem ser repetidas com precisão.

Ajuste a forma e as dimensões da ponta da pipeta. Quando o polimento estiver concluído. Desligue a pressão e aponte a ponta da pipeta em uma direção segura.

Remova a pipeta e coloque-a em uma caixa de armazenamento limpa, onde ficará protegida contra poeira. Para a segurança do laboratório, certifique-se de desligar a pressão antes de remover a pipeta. Caso contrário, ele pode ser ejetado do porta-pipetas.

Após a remoção, acabamos de mostrar como polir pipetas de pressão para melhorar as gravações de patch clamp. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de revestir a bobina de polimento com vidro de alta temperatura de fusão para minimizar a deposição de metal vaporizado nas pipetas. E ter cuidado enquanto as pipetas são expostas ao ar pressurizado.

Certifique-se de que a pipeta esteja firmemente presa no suporte e desligue o ar antes de removê-la do suporte. Então é isso. Obrigado por assistir.

Feliz polimento de pressão e boa sorte com seus experimentos.