Name: Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprenda a polir micropipetas de vidro com pressão e calor para reduzir a resistência sem aumentar a abertura da ponta. Este método melhora a qualidade das gravações patch-clamp em células pequenas.

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A técnica de pressão polimento foi desenvolvido em colaboração com Lockery SR.

Pipetas puxando Usando um filamento como um extrator Sutter P-97 Flaming Puller microeletrodos / Brown, puxe um conjunto de aproximadamente 10-20 pipetas. <ol><li> Selecione seu vidro. Usamos borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Armazenar o vidro com cuidado para que ele permaneça limpo e livre de poeira. </li><li> Conceber um programa de puxar. O principal objetivo é uma dica de abertura aproximadamente o tamanho desejado, que dependerá da aplicação. P-97 Sutter Cookbook Pipetar 2 é uma excelente referência. </li><li> Observe o seu pipetas sob um microscópio para determinar o diâmetro de abertura e suavidade. Descartar áspera, dicas irregular, ou irregular. Para a gravação normal patch-clamp, uma abertura que é de 2-4 mM todo é melhor. A ponta romba leva a menor resistência para o diâmetro mesma abertura, que é o preferido. Forma e tamanho pode ser modificado durante o polimento, abaixo. </li></ol> Polimento pipetas pressão <ol><li> Anexar um suporte para uma pipeta, comprimido limpo linha de ar. Usando um regulador, definir a linha de ar comprimido a pressão para ~ 40 PSI. Conecte a linha de ar comprimido para uma válvula de controle de 4 vias que permitirá que a pressão titular pipeta a ser ligado e desligado. Conectar um titular pipeta para a válvula de controle com um comprimento de ⅛ em Tygon ® tubulação. </li><li> Use um equipamento de polimento (microforge) com um suporte de pipeta de alta pressão, uma bobina de polimento controlada por um pé-pedal, um microscópio equipado com uma ampliação baixa e alta, longa distância de trabalho (idealmente, 10x e 100x) ar objetivos. É fundamental ser capaz de observar a abertura da pipeta durante o protocolo. </li><li> Opcional: Brasão da pipeta com um isolador hidrofóbicos para diminuir a capacitância e melhorar as características de ruído (consulte &quot;pipetas Puxando&quot; para esta técnica). </li><li> Verifique se a válvula de pressão está na posição off. Coloque uma pipeta no suporte de pipetas e aperte o encaixe para os dedos. Nota de segurança: Se a pipeta é mantido firmemente no suporte pipeta, a pressão do ar fará com que a pipeta para ser ejetado do titular da pipeta. </li><li> Coloque a pipeta e titular no microforge. Titular posição da pipeta para o palco microscópio para que tanto a ponta da bobina e polimento são visíveis em potência (10x) baixa na microforge. Traga a ponta ~ 75 microns do filamento. Tenha em mente que o filamento se expande quando aquecida. </li><li> Mude para a alta potência objetivas (100x). Tanto a ponta da pipeta e da bobina de polimento deve estar em foco e no campo de visão. Se não, ajuste a altura da bobina de polimento. (Posição A pipeta não pode ser ajustado). A ponta da pipeta e bobina de polimento deve ser perto de lados opostos do campo de visão. Evite posicionar a bobina muito perto da ponta da pipeta porque vai expandir, uma vez que aquece e chocar-se com a pipeta. </li><li> Gire a válvula para direcionar o ar pressurizado para a pipeta, e aquecer a ponta da pipeta até o cone atrás da ponta começa a balão para fora. </li><li> Parar o aquecimento antes da ponta balões também extensivamente. A experimentação é necessária para determinar a distância apropriada, calor e tempo para a forma desejada. </li><li> Opcional: Reduza o diâmetro de abertura ponta a ponta por polimento, na ausência de pressão. As etapas 7 e 8 pode repetir para ajustar tanto a forma e as dimensões da ponta da pipeta. </li><li> Desligue a pressão e ao mesmo tempo apontando a ponta da pipeta para uma direção segura, retire a pipeta e colocá-lo em uma caixa de armazenamento limpa onde será protegido de poeira. Nota de segurança: Se a pressão do ar não é desligado, a pipeta pode ser expulso do titular pipeta durante a remoção. </li></ol> Notas sobre a microforge Nós usamos um microforge montado a partir de off-the-shelf componentes disponíveis comercialmente. (Você também pode comprar um kit de pressão de polimento de algumas empresas, por exemplo, ALA Ciência, GlassWorx). Independentemente do microforge, é essencial ter ótica que são bons o suficiente para ver a abertura da ponta, que é muitas vezes apenas alguns mM de diâmetro. Nós usamos uma lente de longa distância de trabalho 100x para esta finalidade. Além disso, o revestimento da bobina polimento com alta temperatura de fusão de vidro, a fim de minimizar a deposição de metal vaporizado sobre as pipetas. Parte 3: Resultados Previstos Polimento pressão moderada pode reduzir a resistência de uma pipeta sem uma alteração significativa na abertura de diâmetro. Se desejar, este protocolo pode ser usado para fazer pipetas com sub-micron aberturas e resistências entre 5-10MΩ.

<ol><li>Goodman, M. B., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+polishing%3A+a+method+for+re-shaping+patch+pipettes+during+fire+polishing.%C2%A0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. .</a> J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).</li>
<li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Nós originalmente desenvolvido este método para fazer pipetas útil para patch-clamp gravação 2-3 neurônios M em C. elegans 1. Ele está em uso rotineiro no laboratório Goodman. Nós pipetas pressão polonês não só para a gravação de pequenos C. neurônios elegans, mas também para a obtenção de macropatch e single-channel gravações de canais iônicos expressos em oócitos Xenopus. Para um determinado diâmetro da ponta-abertura, a forma contundente produz uma pipeta de menor resistência. Menor resistência pipet...

<table><tbody><tr><td>Capilares de Vidro</td><td>Descartável</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-85-10 (ou similar)</td><td>O método funciona com qualquer tipo de capilar, exceto os feitos de quartzo. No entanto, recomendamos o uso de capilares com filamento.</td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Microscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL (ou similar)</td><td>Qualquer microscópio invertido simples é adequado. Contudo, é essencial ter ampliação suficiente para visualizar as pipetas durante o polimento. Utilizamos uma lente metalúrgica de 100x com longa distância de trabalho para esse fim.</td></tr><tr><td>Kit de Microforja</td><td>Ferramenta</td><td>ALA Science</td><td>CPM-2</td><td>Fornece bobina de polimento, controlador e pedal.</td></tr><tr><td>Fonte de pressão de ar</td><td>Ferramenta</td><td>ALA Science</td><td>PR-60</td><td>Acessório para fornecer alta pressão, inclui uma válvula adequada. Alternativamente, pode-se usar ar comprimido da instalação combinado com um filtro/regulador (ajustado para 40 PSI) e uma válvula de 4 vias (ver abaixo)</td></tr><tr><td>Válvula de 4 vias</td><td>Ferramenta</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-98150-01</td><td>Serão necessárias conexões para acoplar a válvula à tubulação</td></tr><tr><td>Suporte para Pipeta com Conector Luer</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH-6S20</td><td>Utilize uma conexão macho luer-para-barb para ligar o suporte da pipeta à tubulação de alta pressão</td></tr><tr><td>Tubulação Tygon&amp;#174;</td><td>Ferramenta</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408-62</td><td>Utilize esta tubulação para conectar o suporte da pipeta à válvula de 4 vias</td></tr></tbody></table>

pressão polimento pipetas para gravação de patch-clamp melhorada

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressão polimento é um método para moldar pipetas de vidro para patch-clamp gravação. Nós desenvolvido pela primeira vez este método para a fabricação de pipetas adequado para a gravação de pequenos (&lt;3 m) corpos celulares neuronais. O princípio básico é semelhante ao vidro soprado e combina a pressão do ar e calor para modificar a forma de pipetas de patch preparado por um puxador de micropipeta convencionais. Ela pode ser aplicada aos chamados moles (soda de limão) e rígido (borosilicato) óculos. Polimento de pressão de modo geral, pode reduzir a resistência da pipeta em 25%, sem diminuir o diâmetro de uma abertura (Goodman e Lockery, 2000). Pode ser aplicada a praticamente qualquer tipo de vidro e requer apenas a adição de uma válvula de alta pressão e encaixe a um microforge. Esta técnica é essencial para a gravação a partir de células ultrasmall (&lt;5 m) e também pode melhorar a gravação de um único canal, minimizando a resistência da pipeta. A forma nua e crua é também útil para perfurada-patch clamp gravação uma vez que este resultados ponta forma em uma bolha maior membrana disponíveis para a perfuração.

Este é um guia para modificar a forma de micropipetas de vidro. Especificamente, usando calor e pressão de ar do cone é alargado, sem aumentar a abertura da ponta, levando a menor resistência da pipeta. Isto é fundamental para obter gravações de baixo ruído de pequenas células, mas é útil em muitas aplicações.

Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

O polimento por pressão é um método para moldar pipetas de vidro para registros de patch-clamp. Desenvolvemos primeiramente este método para fabricar pipetas adequadas para...

Este procedimento começa posicionando a ponteira da pipeta próximo ao filamento de polimento com ampliação de 100 vezes. Em seguida, ligue a pressão de ar e o aquecimento. O filamento.A ponta da pipeta irá se expandir para formar uma ponta de formato rombo. Desligue o calor para obter uma abertura menor na ponta. Desligue novamente a pressão e o calor.Olá, sou Brandon Johnson do laboratório da Dra. Miriam Goodman do Departamento de Fisiologia Molecular e Celular da Universidade de Stanford. Hoje vamos mostrar um procedimento para polimento por pressão de pipetas de patch. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar canais iônicos e membranas de patches e neurônios de C. elegans.Então vamos começar. Prepare um conjunto de seis a dez micropipetas para registro em mancha. Consulte um especialista local ou nosso experimento ilustrado sobre como fabricar micropipetas para registro em mancha e eletrodos afiados com um puxador programável para obter ajuda.Para iniciar o procedimento, ajuste a pressão da linha de ar comprimido para cerca de 40 PSI. Em seguida, conecte a linha de ar comprimido a uma válvula de controle de quatro vias. Conecte um trecho de tubo plástico à

pressure-polishing-pipettes-for-improved-patch-clamp-recording

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra como usar um extrator programáveis ​​para fazer pipetas patch e eletrodos afiada para eletrofisiologia. O mesmo procedimento pode ser usado para fazer uma variedade de ferramentas de vidro, inclusive agulhas de injeção.

Tornando-Patch pipetas e Eletrodos Sharp com um extrator programável

Usamos a técnica patch-clamp para medir GABA-activated single-channel correntes (GABAA canais, receptores GABAA) e as correntes sinápticas e tônico que eles geram em neurônios. Ativação dos canais diminui a excitabilidade neuronal na saúde e na...

GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

Este vídeo demonstra uma técnica para gravação de patch-clamp da superfície da membrana dendrítica. Isso ajuda a examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e dos canais iônicos dependentes de voltagem subjacentes em neurônios dopaminérgicos.

Gravações de Patch-Clamp do Dendrito de um Neurônio Dopaminérgico em uma Fatia de Cérebro

Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

As gravações de patch-clamp subcelulares oferecem a possibilidade de investigar as propriedades funcionais dos dendritos. No entanto, essas estruturas finas não são facilmente acessíveis devido ao seu pequeno diâmetro. O protocolo aqui descrito visa facilitar a coleta de gravações estáveis e confiáveis dos dendritos dos neurônios dopaminérgicos em fatias in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

Este protocolo descreve como realizar registros elétricos de espermatozóides de mamíferos em uma configuração de célula inteira, com o objetivo de registrar diretamente a atividade do canal iônico. O método tem sido fundamental na descrição dos perfis eletrofisiológicos de vários canais iônicos do esperma e ajudou a revelar sua identidade e regulação molecular.

Registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos

São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

Este protocolo detalha um método para medir diretamente a atividade do canal iônico em vesículas intracelulares usando um sistema manual de patch-clamp endolisossomal. Ilustramos o método que envolve o aumento dos endolisossomos e o isolamento manual dessas vesículas. Essa abordagem garante que os pesquisadores possam replicar e aplicar o procedimento com precisão.

Técnicas de Patch-Clamp para Análise de Vesícula Endolisossômica Única

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