Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada
22 de outubro de 2008
Este é um guia para modificar a forma de micropipetas de vidro. Especificamente, usando calor e pressão de ar do cone é alargado, sem aumentar a abertura da ponta, levando a menor resistência da pipeta. Isto é fundamental para obter gravações de baixo ruído de pequenas células, mas é útil em muitas aplicações.
Este procedimento começa posicionando a ponteira da pipeta próximo ao filamento de polimento com ampliação de 100 vezes. Em seguida, ligue a pressão de ar e o aquecimento. O filamento.
A ponta da pipeta irá se expandir para formar uma ponta de formato rombo. Desligue o calor para obter uma abertura menor da ponta. Desligue novamente a pressão e o calor.
Olá, sou Brandon Johnson do laboratório da Dra. Miriam Goodman do Departamento de Fisiologia Molecular e Celular da Universidade de Stanford. Hoje vamos mostrar um procedimento para polimento por pressão de pipetas de patch. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar canais iônicos e membranas de patches e neurônios de C. elegans.
Então vamos começar. Prepare um conjunto de seis a dez micropipetas para registro. Consulte um especialista local ou nosso experimento ilustrado sobre como fabricar micropipetas para registro e eletrodos afiados com um puxador programável polar para obter ajuda.
Para iniciar o procedimento, ajuste a pressão da linha de ar comprimido para cerca de 40 PSI. Em seguida, conecte a linha de ar comprimido a uma válvula de controle de quatro vias. Conecte um trecho de tubo plástico à válvula de quatro vias e fixe um suporte de micropipeta de alta pressão à extremidade livre do tubo plástico. Utilize um equipamento microfusor para realizar o polimento.
Utilizamos o kit Ccpm dois da LA Scientific. Este equipamento possui um suporte para pipeta de alta pressão, um filamento de aquecimento de platina controlado por um pedal e um microscópio equipado com objetivas de baixa e alta ampliação, 10 vezes e 100 vezes, respectivamente. Objetivas de distância de trabalho com ar são ideais porque é fundamental poder observar a abertura da pipeta durante o protocolo.
Em seguida, verifique se a válvula de pressão está na posição desligada. Depois, coloque uma pipeta no suporte de pipeta e aperte o encaixe até ficar firme ao toque dos dedos, para a segurança do laboratório. Certifique-se de que a pipeta está firmemente presa no suporte de pipeta.
Caso contrário, a pressão do ar fará com que a pipeta seja ejetada do suporte. Como etapa opcional, você pode revestir a pipeta com um isolante hidrofóbico, como cera, para reduzir a capacitância e melhorar as características de ruído. Agora, coloque a pipeta no suporte e posicione o suporte da pipeta sobre a platina do microscópio de modo que tanto a ponta quanto o filamento de polimento sejam visíveis com aumento baixo de 10 vezes no micro-fulgurador.
Posicione a ponta a aproximadamente 50 micrômetros do filamento, então mude para a objetiva de alta potência de 100, tanto a ponta da pipeta quanto o filamento de polimento devem estar em foco e no campo de visão. Caso contrário, ajuste a altura do filamento. Como a posição da pipeta não pode ser ajustada, a ponta da pipeta e o filamento devem estar em lados opostos do campo de visão.
Evite posicionar a ponta da pipeta muito próxima ao filamento, pois ele se expandirá ao aquecer e poderá colidir com a sua pipeta. Uma vez que a ponta e o filamento estejam adequadamente posicionados, gire a válvula para direcionar ar pressurizado para dentro da pipeta e aqueça a ponta da pipeta até que a região cônica logo atrás da ponta comece a se expandir para fora. Interrompa o aquecimento antes que a ponta se expanda excessivamente.
É necessário realizar experimentação para determinar a distância, o calor e o tempo apropriados para a forma desejada. Como etapa opcional, você também pode polir a ponta na ausência de pressão, a fim de reduzir o diâmetro da abertura da ponta. Além disso, tenha em mente que essas etapas de polimento podem ser repetidas para ajustes finos.
Ajuste tanto a forma quanto as dimensões da ponteira da pipeta. Quando o polimento estiver completo, desligue a pressão e direcione a ponteira da pipeta em uma direção segura.
Remova a pipeta e coloque-a em uma caixa de armazenamento limpa, onde estará protegida contra poeira. Por segurança no laboratório, certifique-se de desligar a pressão antes de remover a pipeta. Caso contrário, ela poderá ser ejetada do suporte da pipeta.
Após a remoção, mostramos como polir pipetas por pressão para melhorar os registros de patch clamp. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de revestir a bobina de polimento com vidro de alta temperatura de fusão, a fim de minimizar a deposição de metal vaporizado nas pipetas. Além disso, é necessário ter cautela enquanto as pipetas estiverem expostas ao ar pressurizado.
Certifique-se de que a pipeta está firmemente segura no suporte e de desligar o ar antes de remover a pipeta do suporte. É isso. Obrigado por assistir.
Boa polimento por pressão e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este guia detalha a modificação de formas de micropipetas de vidro utilizando calor e pressão de ar. O processo permite alargar a região cônica sem aumentar a abertura da ponta, o que é essencial para obter gravações com baixo ruído em aplicações com células pequenas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Fabricação de micropipetas
Contexto
- As micropipetas de vidro são ferramentas essenciais em gravações eletrofisiológicas.
- Uma resistência mais baixa da micropipeta é necessária para gravações de alta qualidade.
- A modificação da forma pode melhorar o desempenho em diversas aplicações.
- Essa técnica é particularmente benéfica para gravações em células pequenas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método para moldar micropipetas de vidro.
- Reduzir a resistência da pipeta sem aumentar a abertura da ponta.
- Melhorar a qualidade das gravações realizadas em células pequenas.
Métodos Utilizados
- Posicionar a ponta da pipeta próxima a um filamento de polimento em alta magnificação.
- Aplicar pressão de ar e calor para expandir a ponta da pipeta.
- Desligar o calor para obter uma abertura menor na ponta.
- Ajustes finais desligando a pressão e o calor.
Resultados Principais
- A ponta da pipeta pode ser remodelada para uma forma romba de forma eficaz.
- É alcançada uma resistência menor sem aumentar o tamanho da ponta.
- Este método melhora a qualidade da gravação em células pequenas.
- Demonstra uma abordagem prática para modificação de micropipetas.
Conclusões
- Modelar micropipetas de vidro é uma técnica valiosa na pesquisa em neurociência.
- O aperfeiçoamento do design da pipeta leva a uma melhor qualidade dos dados.
- Este método pode ser aplicado em diversos estudos eletrofisiológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A politura por pressão de pipetas reduz a resistência elétrica em gravações de patch-clamp sem alterar o diâmetro da ponta, permitindo medições de canais iônicos com maior fidelidade em pequenas populações neuronais. Essa melhoria técnica apoia a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência, ao melhorar as relações sinal-ruído em ensaios eletrofisiológicos. A qualidade aprimorada das gravações aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas precoces da excitabilidade neuronal e da função sináptica.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da função de canais iônicos em neurônios de pequeno diâmetro, essenciais para alvos de dor neuropática e epilepsia.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade em gravações de canais únicos ao minimizar o ruído induzido pelo micropipeto.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz geometrias padronizadas de pipetas para painéis reprodutíveis de triagem eletrofisiológica.
- Valor Operacional: Compatível com micropipetas de vidro duro e macio, permitindo um design flexível de ensaios em diferentes classes de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia aplicações de grampo de perfusão com membrana perfurada ao gerar pontas rombudas que aumentam a formação de blebs na membrana para perfurantes antibióticos.
- Valor Operacional: Prolonga a duração das gravações em culturas neuronais primárias, melhorando o rendimento para estudos de otimização de compostos iniciais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais o fenotipagem eletrofisiológica orienta a seleção de alvos e o perfilhamento de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Permite a validação funcional de alvos de canais iônicos em modelos neuronais relevantes para doenças.
- Triagem: Fornece pipetas de baixa resistência para triagem de compostos com alta fidelidade em plataformas de patch-clamp.
- Análises: Gera medidas quantitativas de corrente e condutância com maior estabilidade do sinal.
- Pesquisa Translacional: Facilita gravações longitudinais em fatias agudas e neurônios cultivados para modelagem farmacocinética-farmacodinâmica.
- Reutilização Empresarial: Requer apenas uma atualização com microfusora, tornando-se uma melhoria escalável e de baixo custo para a infraestrutura existente de eletrofisiologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio de fenótipos eletrofisiológicos mais limpos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade do ensaio entre diferentes locais e operadores ao padronizar a geometria das pipetas.
- Valor Estratégico: Reduz falsos negativos na triagem de canais iônicos ao minimizar o ruído técnico.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de avançar ou interromper programas pré-clínicos voltados à excitabilidade neuronal.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de micropipetas e em eletrofisiologia.
- Exige um microforno com válvula de alta pressão, filamento de aquecimento e óptica de magnificação.
- Exige padronização dos parâmetros de pressão, calor e tempo entre os usuários.
- Deve levar em conta as diferenças do tipo de vidro (vidro de soda-cálcica versus borossilicato) na resposta ao polimento.
- Limitado pela necessidade de posicionamento manual da ponta e pela habilidade do operador para evitar expansão excessiva.
