Исследование сложного поведения в опорно-двигательного Дрозофилы Зависит от способности количественной оценки изменений в движении данного мухи. В этой статье показано, как сделать это с помощью высокого разрешения, системы слежения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мухи обеспечивают важной моделью для изучения сложного поведения из-за множества генетических инструментов, доступных для исследователей в этой области. Изучение опорно-двигательного поведения в
Протокол
Часть 1: Питание и управление мух
- Мухи должны быть выращены в бутылки, содержащие дрожжи без стандартных средствах массовой информации. Вам понадобится большое количество мух, так кресты должны быть установлены соответствующие подходы. Мухи должны быть выращены в 12-часовой световой: темно цикла при 25 º C.
- Мухи должны быть собраны вскоре после eclosion (1-3 дней). Мухи могут быть разработаны на этой стадии использованием диффузора углекислый газ, и должны быть отсортированы в пробирки, содержащие в автоклаве или дрожжей, свободных средств массовой информации. Мы используем только для мужчин, хранится от 10 до пробирке.
- Позвольте по крайней мере день или два после использования диоксида углерода до запуска поведенческих экспериментов. Бежим летит в наши поведенческие анализ 3-5 дней после ECLOSION.
- Анализы всегда должно быть сделано в течение 2-3 час же временное окно каждый день, чтобы избежать вопросов циркадный ритм.
Часть 2: Настройка системы слежения в контролируемой среде
- Все эксперименты проводятся в комнатных условиях, который поддерживает постоянную температуру 25 ° С с 70% влажности.
- Приостановить цифровую видеокамеру над областью для записи (камера направлена вниз). Так как наша программа отслеживания отличие основе, мы приостанавливаем камеры на световой короб. Камера записывает видео непосредственно на Dell компьютеру через FireWire соединение. Мы используем Sharp цифровую видеокамеру, подключить к компьютеру Dell с Windows MovieMaker (Vista-версия) для видео приобретения.
- Воздух импульсов будет управляться в этот протокол, так что источник потока воздуха должны присутствовать в комнате. Использование резиновой трубки, подключить источник воздуха на угольный фильтр для фильтрации воздуха.
- Использование более резиновой трубки, подключите другой стороне угольный фильтр колбу через полую резиновую пробку и заполните колбу около половины дюйма воды. Это будет увлажнять воздух.
- Колба также должны иметь пистолет, который будет подключаться к Y-образный клапан с помощью резиновой трубки.
- Одна ветвь Y-клапан должен быть подключен к расходомера. Другая ветвь должна подавать воздух на площадь камеры передвижения.
Часть 3: Обеспечение летит к передвижению камеры
- Квадратная камера передвижения основана на дизайне от волка и соавт. 2002 1, с добавлением небольшого лотки, чтобы предотвратить падение мух от летящих в камере. Камера должна быть разобрана, а все компоненты должны быть тщательно протирать с 70% этанола и сушат перед использованием.
- Анестезия сразу до проведения поведенческого анализа может привести к нарушению работы. Чтобы избежать этого, мухи осторожно постучал в камеру помощью воронки с небольшим розетки. Для того, чтобы выход нужного размера, придают синие кончика пипетки (для P1000) до конца воронки. Используйте ножницы, чтобы отрезать самом конце наконечником пипетки, чтобы сделать открытие, достаточно большой для лететь, чтобы пройти.
- Начало нашей камере небольшой кусок оргстекла помощи винтов по краям. Когда винты удаляются, дыры могут быть использованы для доставки мух в камере. Позиция оргстекло верхней так, чтобы отверстие для винта сидит прямо над внутренней камере, а не от того, где винт обычно сидит. Возьмите пробирку с мухами и поместите его вверх ногами над воронкой, которая должна быть помещена в отверстие для винта.
- Не перемещайте воронку, так как это может повредить или повреждения мух. Вместо этого, мягко взрыва все камеры, воронку и все, пока все мухи внутри камеры. Этот стук должно быть сделано на коврик для мыши, чтобы поглотить шок этого стучать. Когда мухи внутри, удалите воронку, и вновь позицию топ плексигласа над винтом кровати. Затем снова винт плексигласа топ на место.
Часть 4: Запуск опорно-двигательного Пробирной
- Как только мухи загружена правильно, пусть они акклиматизироваться в камере в течение 30 минут. Этот период акклиматизации должна состояться в контролируемых условиях (25 º С, влажности 70%), а камеры должны быть размещены в верхней части светового короба (который должен быть включен). Включите другие огни комнаты прочь.
- После акклиматизации период, переключатель Y-клапан в системе воздушного потока так, что воздух будет только поток расходомера. Включите воздух, и рампы воздуха до желаемой скорости (4,0-6,0 л / мин). Мы обычно используют 5,0-5,5 л / мин, но любой скорости в этом диапазоне будет работать.
- Как только желаемый воздушной скорости достигается, переключатель Y-клапан так, чтобы воздушные потоки для передвижения камеры. Время этого воздушного импульса в течение 15 секунд, а затем резко повернуть воздуха выключен. При повороте с воздуха, включите камеру в режим записи. (Эта часть нужна практика, чтобы сделать все сразу).
- Остановить запись после нужное время и SAVE. Мы записываем 30 секунд испытания с частотой 10 кадров в секунду (по крайней мере 8 исследований в генотипе).
Часть 5: Анализ Видео
- Мы используемДинамическая система анализа изображения (ДИАС) программного обеспечения 3.2 для отслеживания движения 2. Для того, чтобы использовать это программное обеспечение, мы сначала преобразовать наше видео формата AVI с Quicktime 7.5.5.
- Для отслеживания мухи на основе контраста, мы используем "Autotrace на пороге" функции. Затем мы используем "Make Путь от следа", чтобы оцифровать эти следы.
- Для вывода мгновенной скорости каждого летать, мы используем "Вычислить параметры", чтобы производить файл базы данных (DIAS специфику). Используя эту функцию, мы также гладкие данные с помощью "5,15,60,15,5" Тьюки Сглаживание Window.
- Как только эта информация выдается в виде файла базы данных, он может быть открыт в Microsoft Excel. Мы используем сценарий Matlab для компиляции мгновенной скорости движения в Excel и вычислять дополнительные параметры, необходимые для понимания динамики движения и боя структуры.
Представитель Результаты:
На рисунке 1 показана представитель следы от организмы дикого типа Кантон S (рис. 1, слева) и мух нуль для dCASK ген, были получены путем скрещивания двух крупных перекрывающихся делеций (Df (3R) x307 и Df (3R) x313) (рис. 1 , правая панель). мух dCASK нулевой Ранее было показано, что проблемы с использованием опорно-двигательного Paradigm буриданова 3, а в нашей парадигмы, по сравнению с Кантона S, они показывают значительно снизилась передвижения. Мы всегда одичал организмов типа сначала, чтобы удостовериться, что условия и поведение в пределах нормы на данный день. Мы наблюдали отклонения от стандартных ответов менее чем 5% от тестирования дней. Эти различия могут быть классифицированы проблемы с параметрами нашего контролируемой среде.
Рисунок 1. ДИАС генерируемых следы и Кантон S диких мух типа (выше, слева) и опорно-двигательного-дефицитных dCASK Null мухи генерируется из перекрывающихся делеций (выше, справа). Следы представляют собой то, что видел в видеозаписи. Обе картины contrain следы от 8-10 мух работать в течение 30 секунд в анализе отслеживания видео следующие воздуха импульса.
Рисунок 2. Дикие мухи типа были проведены в опорно-двигательного анализа (см. выше) после импульса воздуха (фиолетовый бары) и без воздуха импульса (синий). Во всех параметров рассчитывается путем анализа программы, не было никаких существенных различий между этими двумя условиями (определяется с двумя хвостами студент т-тест). Это свидетельствует о том, что после импульса воздухе, летит передвигаться как правило, в нашей установке.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В нашей установке умеренно сильный воздушный импульс временно останавливает летать движения. Когда импульс воздух заканчивается, мухи освобождаются от этого стационарного состояния и передвигаться нормально, как показано на рисунке 2. Потому что этот импульс воздуха эффективно синхронизирует передвижения населения, мы используем его, чтобы начать судебный процесс, чтобы мы могли ознакомиться также с началом движения следующие импульса нарушение стимул. Анализа, однако, может быть сделано без воздушного импульса с опорно...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья Грант R01 GM54408 присуждена LC Гриффит. Мы хотели бы поблагодарить Фреда Вольфа за всю его помощь в проектировании наш квадрат камеры и создания нашего анализа, Фрэнк Мелло в машине Brandeis University магазин для построения нашей камере, и Дэн Валенте и Тим Lebestky за полезные разговоры относительно анализа проблем.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Квадратная камера | Инструмент | Machine Shop | Н/Д | Дизайн по Wolf et al. 20021 |
| Цифровая камера | Камера | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Расходомер | Инструмент | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Световой бокс | Инструмент | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Угольный фильтр | Инструмент | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Программное обеспечение | Soll technologies | Н/Д | www.solltechnologies.com |
Ссылки
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
