Здесь мы показываем, цитоплазматические микроинъекции Xenopus laevis Ооцитов с ядерным субстратом импорта, а также подготовка ооцитов вводили для визуализации на тонких срезов электронной микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микроинъекции Xenopus laevis ооциты затем тонких срезов электронной микроскопии (ЭМ) является отличной системой для изучения nucleocytoplasmic транспорта. Из-за своего большого ядра и высокой плотности ядерного комплексов пор (НПС), перевозка ядерного материала может быть легко визуализированы в ооцитов Xenopus. Многое понимание механизмов ядерного импорта и экспорта был накоплен за счет использования этой системы (см. обзор Panté, 2006). Кроме того, мы использовали микроинъекции ооцитов Xenopus препарировать ядерной пути импорта из нескольких вирусов, которые воспроизводят в принимающей ядра.
Здесь мы показываем, микроинъекции цитоплазмы ооцитов Xenopus с ядерным субстратом импорта. Мы также показываем, подготовка ооцитов вводили для визуализации на тонких срезов EM, в том числе рассечение, обезвоживание, и вложение ооцитов в смоле вложение эпоксидной смолы. Наконец, мы предоставляем представителя результаты для ооцитов, которые были microinjected с капсида из бакуловирус Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) или вирусов парвовирус Минута Мыши (MVM), а также обсудить возможности применения техники.
Протокол
Часть 1: Подготовка ооцитов Xenopus для микроинъекции
- Место небольшой кусочек (около 2 см) яичников Xenopus laevis в 50-мл коническую трубку, содержащую 20 мл коллагеназы решения (5 мг / мл коллагеназы в кальции без солевых изменение Барта: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,82 мМ MgSO 4, 10 мМ HEPES, рН 7,5). Коллагеназа используется для удаления фолликула клетками, которые окружают ооцитов.
- Поместите пробирку на платформе шейкера и рок-это мягко (при 100 оборотов в минуту) в течение одного часа. На этот раз меняется в зависимости от разных партий коллагеназы. Таким образом, после одного часа, взять небольшой образец ооцитов и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микроинъекция ооцитов Xenopus в сочетании с тонкими секционирования EM является весьма эффективным инструментом для изучения nucleocytoplasmic транспорта. Эта система была использована для перевода различных шагов импорта через NPC, например, взаимодействие ядерных подложки импорта со структурными компонентами NPC, таких как цитоплазматических и ядерных нитей корзине (обзор Panté, 2006). Он также был использован для изучения ядерных импорт ядерного репликацию вирусов (Panté и Канн, 2002; Рабе и др., 2003;.<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы благодарим Дэвида Theilmann (Тихий Agri-Food Research Centre, Summerland, Британская Колумбия) за предоставление бакуловирус AcMNPV и полезные обсуждения.
Эта работа была поддержана грантами от Канады Фонд инноваций (CFI), канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), Майкл Смит фонда исследований в области здравоохранения (MSFHR), и естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC) .
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
- Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
