Достижение высокого качества и соответствующего количества человеческих островков является одним из видных предпосылки для успешной трансплантации островок. В этом видео мы опишем шаг за шагом процедуры человеческой изоляции островков поджелудочной железы (часть I: пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы), с помощью модифицированного метода автоматизированного.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть I: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Управление диабетом 1 типа является обременительной, как для личности и общества, стоимостью более 100 миллиардов долларов в год. Несмотря на широкое использование мониторинга уровня глюкозы и новые формулировки инсулина, многие люди по-прежнему развиваться разрушительных вторичных осложнений. Трансплантация островков поджелудочной железы может восстановить около нормы контроля уровня глюкозы у больных сахарным диабетом
Протокол
1. Фонд установки
- Человек изоляции островок времени чувствительны процедура, которая включает в себя работу в команде, и, следовательно, четыре человека, которые необходимы для проведения этой процедуры. Команда под руководством хирурга, который анализирует и cannulates поджелудочной железы.
- Изоляции островок начинает минуту команда входит МСЖД объекта изоляции островок. Члены команды обеспечить принятие всех необходимых приборов, таких как центрифуги, проверено и включено. Кроме того, они обязательно дезинфицировать все капюшоны и поверхностей.
- Два человека будут созданы катетеризации стол, слякоти машину, пищеварение цепи, перфузии блок, COBE машины очистки и хирургических столов.
- Одновременно двое других членов команды подготовят средств массовой информации, которая необходима при выделении.
- Далее, бактериологии труб (бутылки, трубки, формы и сумки), отбор проб трубки (предварительно заполнены стирка), а также оценку трубок и пластин готовы.
- Подготовка очистки трубки устанавливается следующим образом: первая труба пуста и отмечена на 150 мл, 2-12 трубы заполнены 200 мл M199 среде с человеческий альбумин (промывочного раствора) и отмечены на 230 мл, и, наконец, один 50 мл коническую трубку заполнено 50 мл моющего раствора. После этих подготовительных шагов полная мы готовы приступить к подготовке и перфузии поджелудочной железы.
2. Подготовка поджелудочной железы и перфузии
- Для начала подготовки и кровоснабжение поджелудочной железы, оператор снимает органа от упаковки с использованием стерильной техники. Хирург передачи поджелудочной железы обеззараживания таблице.
- Хирург заполните одну 60 мл шприц с оригинальным решением сохранение поджелудочной железы и передать ее оператору, который будет использовать его, чтобы заполнить подготовленные «Закупки» бутылки бактериологии.
- После визуального осмотра, чтобы определить орган подходит для островок изоляции (Если поджелудочная железа повреждена во время закупок или анатомически ненормальным, оно не может быть использован для изоляции островок), хирург попросит оператора подготовить коллагеназы. Помните, что повторное приостановление время варьируется у разных брендов фермента и много.
- Когда хирург готов, принести обеззараживания решений (Бетадин, Fungizone / Цефазолин и HBSS) для обеззараживания стол и вылить их в соответствующие контейнеры. Хирург выполняет поджелудочная железа обеззараживание стиральную на минуту поджелудочной железы в каждой из обеззараживание раствором. Поджелудочная железа помещают в небольшие стерильные банки, в которых он будет взвешен. После вес вступил в партию записи, поджелудочная железа находится в катетеризации кастрюлю с некоторым сохранением решение.
- Хирург разоблачить и частично надрезать основной проток и иглу каждой половины поджелудочной железы с канюли. Канюля будут обеспечены шва. Чтобы заливать поджелудочной железы, первый шаг это единица перфузии и залить раствор фермента в бассейне. Общее время перфузии составляет около 10 минут, при 80 мм рт.ст. в течение 5 минут, затем при 180 мм рт.ст. в течение 5 минут. Поджелудочная железа раздутым после перфузии.
- Перемещение перфузии поджелудочной железы катетеризации кастрюлю, где жировая ткань удаляются из поджелудочной железы тщательно. Затем вырежьте поджелудочной железы в 10-12 штук и передачи Ricordi палаты для пищеварения.
3. Поджелудочная железа пищеварения
- Для начала пищеварения шаг, передача поджелудочной железы в пустую палату Ricordi, добавьте 2,5 мл флакон Pulmozyme, положить на экране (во избежание большой кусок ткани блок камеры), закрыть камеру, и заполнить систему.
- Начинайте выкачивать раствор в течение 5 минут. Осторожно камеры равномерно расходиться теплый раствор во всем. Через пять минут, осторожно встряхните камера для всей фазы пищеварения. Поддерживайте температуру 37 ˚ C.
- Рок камеры мягко, пока температура не достигнет 37 °, то трясти камеру. Возьмите образец каждые две минуты и обнаружить, если свободные островки находятся под область. Запись информации островок оценки в пищеварении таблицу партии записи. Продолжайте следить за процент островков, пока Есть 50% из них плавающей свободные и изолированные в растворе.
4. Ткани коллекции
- Как только 50% находятся островки свободной в образцах, пищеварение останавливали добавлением холодной RPMI разбавления раствора в контуре. Ткань собирается в 500 мл конические пробирки предварительно заполнены 30 мл альбумина человека. Как только трубы развернулся, всасывания от супернатант и мыть гранул с холодной промывочного раствора. Спиновые конических труб при 1100 RPM (оборотов в минуту) в течение 1 минуты, 4 ˚ C.
- Смешайте все коллекции трубы приостановлены с переваривается ткани поджелудочной железы в одной 500 мл конической. Когда трубка полна мыть ткань, спину и повторить процесс стирки, пока все ткани была мыть несколько раз. Спиновые эту трубку и передачи ткани в одном 250 мл коническую трубку. Довести объем до 250 млM199 моющего раствора дополнить ГК и подготовить для отбора проб.
- Возьмите 1 мл образца с пипеткой и добавить в 15 мл коническую трубку предварительно заполнены 9 мл моющего раствора. Затем смешать, аккуратно инвертирующего 15 мл коническую трубку и от этого, выборка из 1 мл прямо в сетку подсчета блюдо. Граф клеток, и рассчитать количество клеток использованием коэффициент разбавления 2500 (10x250).
- Спиновые 250 мл коническую трубку и добавить 150 мл UW (Университет Висконсина) Решение, которое обычно используют для сохранения органов. Когда UW добавляется, смешать клеточной суспензии тщательно с использованием пипетки. Запись и сообщить оператору очистки время начала в UW. Оставьте трубку (ы) на льду и водоворот случая к случаю. Теперь островки могут быть очищены дальше.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть множество факторов, влияющих на изоляцию результат 9,10. Среди них, переваривания ткани поджелудочной железы играет важную роль. Исходя из нашего собственного человеческого опыта изоляции островке, мы кратко изложены следующие критические точки, которые потенциально могут влиять на островке урожайность и качество.
- Пищеварения раз по-другому, когда различные виды ферментов используются.
- Как только 40-50% от островков полностью отделены от тканей ацинарных, пищеварения следует немедленно прекра...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Поддержка финансирования из университета Иллинойса в Чикаго, а также островковых клеток ресурсный центр NIH грант (RFA-RR 05-003), Кристофер Фонда Efroymson Фонда, а Фонд Tellabs.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Машина для приготовления ледяной кашицы | оборудование | Компания Taylor | K4036546 | приготовление стерильного льда |
| Центрифугирование | оборудование | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Инвертированный микроскоп MZ6 с TLBD4.1 | оборудование | Leica Microsystems | 4103 | |
| Чашка для культивирования клеток с сеткой 2 мм | оборудование | Nalge Nunc international | 174926 | подсчет островков |
| Цифровая водяная баня EX7 | оборудование | NesLab | 105361058 | |
| Термометр | Оборудование | ММП:ИК | 60444 | |
| Весы MonoBloc Balance AB 104-S | оборудование | Mettler Toledo | 1119430864 | измерение массы поджелудочной железы |
| Контроллер скорости MasterFlex II | оборудование | Cole-Parmer | **Метод выделения РНК из тканей растений с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit** **Абстракт** Выделение высококачественной РНК является критически важным этапом для последующих молекулярно-биологических исследований, таких как количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) и секвенирование РНК. Ткани растений представляют собой сложный субстрат для экстракции нуклеиновых кислот из-за наличия клеточных стенок, а также высокого содержания полисахаридов и вторичных метаболитов, которые могут ингибировать ферментативные реакции. В данном видео демонстрируется протокол выделения общей РНК из тканей растений с использованием набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), который основан на методе силикатной адсорбции. В видео подробно описаны этапы гомогенизации образцов, лизиса клеток, очистки и элюции РНК. Особое внимание уделяется техническим аспектам, обеспечивающим предотвращение деградации РНК под действием эндогенных РНказ. Данный метод позволяет получить чистую РНК, пригодную для анализа экспрессии генов и других приложений молекулярной биологии. **Ключевые слова** выделение РНК, ткани растений, RNeasy Plant Mini Kit, силикатная адсорбция, гомогенизация, экспрессия генов, РНКазы | регулировка скорости потока во время переваривания |
| Цифровой прицел DS L1 | оборудование | Nikon Instruments | 217267 | |
| Блок перфузии | оборудование | Изготовлено на заказ | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте текст для перевода. | |
| Охладитель для установки перфузии | оборудование | Fisher Scientific | 3013P | |
| Камера Рикорди | оборудование | Университет Майами | Данные отсутствуют | |
| раствор для разведения RPMI | реагент | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| раствор Висконсинского университета (UW) | реагент | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Хэнк’сбалансированный солевой раствор в Хенксe (HBSS) | реагент | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% раствор человеческого альбумина | реагент | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| среда M199 (промывочный раствор) | реагент | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Коллагеназа NB1 GMP-класса | реагент | Электрофорез SERVA | N0002937 | |
| Нейтральная протеаза NB1 грейда GMP | реагент | Электрофорез SERVA | N0002936 | |
| Betadine | реагент | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Цефазолин | реагент | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Дитизон | реагент | Sigma-Aldrich | D5130 |
Ссылки
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
