Изготовление Миогенный Engineered Создает тканей

Краткое содержание

Здесь мы демонстрируем, изготовление коллагена основе, тканевые конструкции содержащего скелетных миобластов. Эти 3-D инженерных конструкций может быть использован для замены или ремонта тканей В естественных условиях. Для наших целей мы разработали их как атриовентрикулярного электрических каналом для ремонта полной блокадой сердца ^[1].

Аннотация

Несмотря на то, что электронные кардиостимуляторы являются жизненно медицинских приборов, их долгосрочную работу в педиатрической практике может быть проблематичным из-за ограничений, налагаемых небольшой размер ребенка и их неизбежного роста. Следовательно, существует реальная потребность в инновационных терапий, разработанный специально для педиатрических пациентов с нарушения сердечного ритма. Мы полагаем, что проводящие биологические альтернативные, состоящий из коллагена основе матрицы, содержащей autologously клеток, полученных могли лучше адаптироваться к росту, снизить потребность в периодических операций, а также значительно улучшить качество жизни этих пациентов. В настоящем исследовании мы опишем процедуру включения первичных культурах клеток скелетных миобластов в гидрогель матрицы моде хирургически-имплантируемых тканей конструкция, которая будет служить связующим звеном между электрическими верхней и нижней палат сердце. В конечном счете, мы ожидаем, используя этот тип инженерии тканей для восстановления атриовентрикулярного электрической проводимости у детей с полной блокадой сердца. В связи с этим, мы выделяем миобластов из скелетных мышц у новорожденных крыс Льюиса и пластины их на ламинин покрытием культуре ткани блюда с использованием модифицированной версии установленными протоколами

Протокол

Часть 1: Соберите построить литейных форм

1. Используйте лезвие сократить вдвое силиконовые трубки (VWR) и разрезать его на 3 см длиной штук.
2. Место падения имплантата класса RTV силиконовый клей (Rhodia) на внутренней стороне каждого конца трубки.
3. Быстро месте небольшой кусочек (1 см х 1 см) из полиэфирной сетки (McMaster-Карр) на падение силиконовый клей и согласовать ее с конца трубы. Это позволит слегка приподняты и плоскую поверхность для построить вложение. Повторите для другой стороны.
4. Разрешить форму сушить при комнатной температуре в течение 3 дней. Это полезно сделать от 20 до 30 форм в то время, как эти по сути одноразовыми.
5. Как только клей полностью высохнет, хранения этих форм в стакан заполнен на 70% этанола, пока они не нужны. Этот шаг поможет стерилизовать пресс-форм и готовой продукции показана на рисунке 1.

Часть 2: Подготовка к миобластов изолятор

1. Развести 1 мг Ламинин (Sigma) в 250 мл 0,22 мкм фильтр-стерилизовать фосфатным буферным раствором (PBS), содержащем 1% пенициллина / стрептомицина (Invitrogen) и 1% Fungizone (Invitrogen).
2. Пальто 150 мм пластин культуре ткани (BD Falcon) с 4 мл разведенного раствора Ламинин с шагом 1,1 и инкубировать при температуре 37 ° С в течение по крайней мере за 4 часа до покрытия первичных скелетных миобластов.
3. Сделать миобластов средой путем смешивания F-10 Хэма питательной смеси (Sigma) с 20% FBS (Атланта биологические препараты), 5 нг / л основной фактор роста фибробластов (Promega), 1% пенициллина / стрептомицина (Invitrogen), и 1% Fungizone ( Invitrogen).
4. Подготовка скелетных мышц решение пищеварения, растворяя 1 г ~ 295 ед / мг Коллагеназа 2 (Уортингтон) в 100 мл 2,4 Ед / мл Dispase-2 (Roche). Добавить 0,037 г CaCl ₂ и хорошо перемешать. Фильтры стерилизовать пищеварения буфера, используя фильтр 0,2 мкм диск устанавливается на 10 мл шприц и хранить аликвоты при -20 ° C. Место суммы, необходимой для переваривания ткани при температуре 37 ° С, наряду с миобластов СМИ.

Часть 3: миобластов изоляции от скелетных мышц

1. Использование щипцов и маленькие ножницы, удалите параспинальная мышц из мертвых новорожденных крыс Льюиса, нарезая на спине вдоль позвоночника, шелушение кожи спины и шеи слои, а затем иссечения мышц.
2. В капотом культуры ткани, место вырезанной мышцы в 50 мл коническую трубку (BD Falcon) заполнены 40 мл 1X Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) (Invitrogen) на льду. Разрешить мышц полосок для оседают на дне пробирки и тщательно удалить большую часть жидкости и крови остатки от вакуумного отсоса с стерильные пипетки Пастера в культуре капот (Baker).
3. Налейте собрано части мышц на 150 мм культуры блюдо и удалить как можно больше из оставшейся жидкости, насколько это возможно всасывание. Используя 2 однолезвийный лезвия фарш ткани густой пасты. Налейте подогретого раствора на пищеварение пасты и передачи смесь 50 мл свежего трубки с использованием 10 мл пипетки. Во время ферментативного пищеварения, ткани, иногда растирали в порошок (без восходящей) с 10 мл пипетки устанавливается на беспроводные Внесите-Aid (Drummond). Опять же, позволит урегулировать ткани и удалить лишнюю жидкость.
4. Место трубки на качалке платформы и переварить при 37 ° С в течение примерно 30 мин.
5. Как только мышцы сжиженный, проходят раствора через 70 мкм ячейки фильтра (BD Falcon) и центрифуги при комнатной температуре в течение 10 мин при 600 мкг (Beckman GP). С пипетки Пастера и всасывания, удалить как можно больше жидкости, как это возможно и ресуспендируют осадок с 10 мл теплой среде миобластов.
6. Предварительно пластина ячеек на 150 мм без покрытия тканевой культуры пластине в течение 15 минут, чтобы помочь устранить фибробластов.
7. Передача клетки, которые еще не прикреплен к ламинин покрытием cultureware и разбавленных так, что есть одна пластина для каждого от 1 до 2 крысят. Место пластины в увлажненной термостат при температуре 37 ° C с 5% CO _2.

Часть 4: Литье инженерных конструкций ткани (5 мл)

1. После 1 до 2 дней, удалите 10 из 150 мм миобластов культуре ткани пластины из инкубатора, промойте их в два раза с 37 ° C 1X PBS, и добавить 4 мл теплого 0,05% трипсина-EDTA в каждую тарелку. Вернуться пластин инкубаторе в течение 5 мин.
2. Harvest отдельностоящий миобластов из пластин в культуре капот и собрать жидкость в 50 мл трубки (BD Falcon). Используйте 10 мл миобластов среда для полоскания все тарелки и совместить это с клетками в центрифуге трубки. Гранул клетки при комнатной температуре в течение 10 мин при 600 мкг (Beckman GP) и удалить лишнюю жидкость, как описано в пункте 3.5.
3. Ресуспендируют миобластов клеток в 1,6 мл среды миобластов и место на льду.
4. Использование щипцов, тщательно удалить 4 строить формы, начиная с шага 1.5 и промойте их в два раза с 1X PBS. Вакуумные всасывания от всех следов PBS с пипетки Пастера до размещения каждой формы в 6-а у.е. тканиlture пластины (BD Falcon).
5. Соберите другие реагенты, необходимые для подготовки построить (F10 10X Хэма, антибиотики, 1-го типа коллагена [3,9 мг / мл] ^[6] и Матригель ™) на льду и держать миобластов СМИ при 37 º C. Комбинат 500 мкл 10X Хэма F10, 100 мкл Пенициллин / стрептомицин, 100 мкл Fungizone, 1,6 мл коллагена, и 750 мкл ™ Матригель в 15 мл коническую трубку. Смешайте раствор на 10 сек использованием мини-Vortexer (VWR) установлен в 10 и место на льду.
6. Затем добавьте 80 мкл NaHCO ₃ и миобластов отстранение от шага 3,3 до смеси из шага 3.5. Vortex всю смесь в течение 10 сек и вернуть трубку ведерко со льдом в течение нескольких минут, чтобы очистить решение пузыри.
7. Тщательно литой смеси в формы, прежде чем он начинает затвердевать использованием 10 мл пипетки. Каждая форма будет принадлежать примерно 1 мл вязкой жидкости. Старайтесь избегать введения пузырьков воздуха во время этой процедуры.
8. Тщательно передачи пластины, содержащей литые конструкции для инкубатора. После ~ 30 мин, удалить затвердевших конструкций из инкубатора и осторожно добавить миобластов среду в каждую лунку, чтобы покрыть ткань конструкции. Вернуться пластину инкубаторе (рис. 2).

Часть 5: Представитель результаты

При этом протокол надлежащим образом оформленные, миобластов, содержащие ткани построить готов к имплантации в естественных условиях (например, когда вынимается из формы) или для дальнейшего анализа в пробирке через 2 дня.

Рисунок 1. Примеры выполненных построить формы (см. шаг 1.5).

Рисунок 2. Затвердевших миобластов содержащие ткани построить ^[1].

Рисунок 3. H & E окрашенных срезах миобластов содержащие ткани конструкции. "" Изображает продольный разрез и "B" показывает поперечное сечение.

Обсуждение

Формы, в которых ткани строить будут брошены может быть сделано в любой форме и размеру, однако, там должно быть не менее двух точек крепления. В противном случае, матрицы и клетки образуют сферические структуры и клетки погибают. В настоящее время протокол, мы описываем использование полиэфирной сетки для этой цели, но мы также успешно используется сетка из нержавеющей стали. Очевидно, что большие формы потребуется больше клеток и больший объем других ингредиентов. При создании формы, важно, чтобы свести к минимуму кол...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Силиконовые трубки	VWR international	60985-724
Силиконовый адгезив	Rhodia Silicones	MED ADH 4300 RTV
Полиэфирная сетка	McMaster-Carr	93185T17
Ламинин	Sigma-Aldrich	L2020
Питательная смесь F-10 HAM	Sigma-Aldrich	N6908
Фетальная бычья сыворотка	Atlanta Biologicals	S11550
Пенициллин/стрептомицин	Invitrogen	15140
Фунгизон	Invitrogen	15290-018
Диспаза-2	Roche Group	10295825001
Коллагеназа 2	Worthington Biochemical	46H8863
Основной фактор роста фибробластов	Promega Corp.	G5071
Чашки для культивирования тканей 150 мм	BD Biosciences	353025
0.05% (1X) Трипсин-ЭДТА	GIBCO, by Life Technologies	25300
1X сбалансированный солевой раствор Хэнкса	Invitrogen	14170-112
7.5% NaHCO3	GIBCO, by Life Technologies	25080-094
Клеточный фильтр 70 μm	BD Biosciences	352350
6-луночные планшеты	BD Biosciences	353046
Конические пробирки 50 mL	BD Biosciences	352098
Конические пробирки 15 mL	BD Biosciences	352099
Фильтр 0.2 μm	Nalge Nunc international	194-2520