$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Протокол
Часть 1: Подготовка к микроинъекции
- Подготовка к инъекции, потянув капиллярных игл использованием Саттер инструменты игла съемника.
- Заполните игла с флуоресцентной краской (такие как Техас-красный Декстран).
- Горы иголку в аппарате микроманипулятора и микроинъекции.
- Вырезать иглу соответствующего размера под углом для создания скошенных чаевые.
- Измерьте размер капли и убедитесь, что он находится между 1-2nl на инъекцию в масле.
Часть 2: Подготовка эмбрионов
- Inject эмбрионов 30 минут раньше, чем этап интерес. Например, для исследования желудочков через 24 часа после оплодотворения (HPF), ввести эмбрионов на 23,5 HPF. Этап эмбрионов в соответствии с Киммел и соавт. (4).
- Под стереомикроскопа, осторожно удалите хориона с использованием эмбрионов щипцами.
- Использование пластиковых блюдо покрытием с 1% агарозы, ткнуть отверстия в агарозном с пластиковыми 1-200 мкл кончика пипетки. Осторожно снимите агарозном заглушки из отверстий использованием щипцов.
- Трансфер эмбрионов в зачаточном состоянии СМИ в блюдо агарозы с отверстиями.
- Добавить tricaine (производится в соответствии с Уэстерфилд (5)) к СМИ, чтобы обезболить эмбрионов и предотвратить смещение во время эксперимента.
- Аккуратно эмбриона хвостом вниз в дыру, и ориентируем его так, что инъекции аппарата находится на задней стороне эмбриона.
Часть 3: Потребители инъекционных желудочков мозга
- Чтобы придать желудочков мозга, организовать микроманипуляция установки так, чтобы кончик иглы находится в том же поле зрения, как эмбрион на высокой мощности.
- Осторожно введите иглу через тонкие roofplate заднего мозга только сзади r0/r1 hingepoint, не поражая ткани мозга ниже.
- Inject достаточно красителя, чтобы полностью заполнить желудочков. Это может занять несколько инъекций, чтобы заполнить пространство желудочка, в зависимости от стадии эмбриона.
Часть 4: изображений
- Используя чистую 1% агарозном покрытием блюдо, тыкать новые дыры в блюдо, удалить пробки, а также добавить к tricaine обезболить эмбрионов и предотвращения движения.
- Место хвост желудочка впрыском эмбриона в отверстие и положение для спины изображения.
- Возьмите изображения с помощью проходящего света.
- Это очень важно не двигаться эмбриона или микроскоп.
- Изменение параметров микроскопа и принимать изображения с флуоресцентным светом.
- Изменение положения эмбриона принять боковые изображения с обеих проходящем свете и флуоресцентного света.
- Сохранить изображение в виде файлов формата TIFF для обработки изображений в Photoshop.
Часть 5: Обработка изображений
- Для обработки изображений в Photoshop, откройте проходящего света и дневного света изображений одного эмбриона, принятых в том же положении. Будьте уверены, все настройки те же для каждого изображения.
- Перетащите флуоресцентные изображения на проходящем свете изображения и выстроить их точно.
- С флуоресцентное изображение выбрано, выберите "Изображение", "Корректировка", а затем "Заменить цвет" и изменить черный фон на белый.
- В "Заменить цвет" окна настройки "размытости" фактор, вплоть до флуоресцентных изображений выглядит однородным по цвету.
- В "Слои" окно, выберите "Multiply", чтобы просмотреть наложения изображений. Ваш желудочка пространстве изображения должны соответствовать передаваемого изображения свет точно.
- Сохраните этот файл и повторите для любых других изображений.
Представитель Результаты / Результаты
Правильное желудочка изображения инъекции показано на рисунке 1 панелей н.э., в то время как пример некорректного изображения инъекции показаны на ЕН. Правильное инъекции имеют острые края и не диффузный красителя. Неправильное инъекции, которая возникает, когда игла вводится слишком далеко в желудочке и хитов мозговой ткани ниже, может привести к краситель, который виден за пределами желудочка пространстве и в желтке.
Рисунок 1. Желудочка инъекций 25 HPF диких эмбрионов типа. (AD) Правильный метод инъекции и (EH) неправильным методом инъекции приведены в качестве примеров. (А, Е) Спинной образы светлого с соответствующими флуоресцентные изображения (B, F) и наложение люминесцентных и светлого изображения (C, G) и для правильного и неправильного инъекционные методы показано на рисунке. Стрелками указаны регионы, где краситель вышел за пределы пространства желудочков мозга из-за неправильной инъекции желудочка (см. "Устранение неисправностей"). Передняя находится слева на всех изображениях.
Устранение неполадок:
| Проблема Вызывать | Средство |
| Вы давя эмбриона с иглой. | Ваша игла слишком тупой или наконечник слишком велик. | Начните с новой иглой и не разбить его, как далеко назад. Bevel иглу, чтобы сделать его резким, как иглы шприца. |
| Краситель всей эмбриона и желтком (см. рис 1E-H). | Ваша игла прошла через ткань и не остался в желудочке пространства. | Ваша игла не может быть достаточно острым, так что вы не в состоянии контролировать скорость прокола. |
| Краситель слишком слабы или не в переднем мозге. | Вы не использовали достаточно высокого давления для инъекций, или ваша игла не была достаточно далеко впереди достигают переднего мозга, когда вы вводили краситель. | Повысьте давление впрыска или разместить иглу чуть более передним во время инъекции. Вы можете поставить иглу через средний мозг, задний мозг границе, если более подробно, что требуется в переднем мозге. Вы также можете просто подождать немного для красителя дальнейшего диффузной до визуализации. |
| Ваш флуоресцентные изображения темные по краям после замены цветов в Photoshop. | Вы забыли изменить "размытости" настройки в окне заменить цвет. | Перемещение "размытости" вплоть до прямо в окне заменить цвет. |
| Игла не будет прокол заднего мозга roofplate. | Ваша игла не вырезано должным образом. | Сделать новую иглу. Если вы делаете много инъекций вам может понадобиться несколько игл, как они могут получить скучно. |