Не-человеческое приматов является важным поступательное видов для нашего понимания развития и старения. Анатомическая организация приматов сетчатки может предоставить важную информацию о нормальных и патологических состояний у человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ворота в мозг: Пройдя Предстоятель глаз
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Зрительной системы у человека считается воротами в мир и играет основную роль в множество сенсорных, перцептивных и когнитивных процессов. Поэтому не удивительно, что качество зрения связана с качеством жизни. Несмотря на широкое клинических и фундаментальных исследований окружающей причин визуальные расстройства, многие формы нарушения зрения, такие, как пигментный ретинит и дегенерация желтого пятна, отсутствие эффективных методов лечения. Номера для человека приматов имеют самые тесные общие черты развития глаза, что и люди. Мало того, что они имеют аналогичный сосудистой анатомии, но и среди других млекопитающих, приматы имеют уникальные характеристики, имеющие региона в височной сетчатки специализируется на высокую остроту визуальных, ямки
Протокол
Часть 1: Предварительная обработка тканей
- Ткань должна быть хорошо озарен параформальдегида, глутаральдегида или формалина. Это может быть достигнуто с помощью стандартных transcardial перфузии обычно используется для сбора других органов. Рекомендуется, что вскоре после жертву глазами быть введен с фиксатором только под объектив и хранится в фиксаторе.
- В настоящем исследовании тема глубоко седативные с кетамин гидрохлорид (10 мг / кг, внутримышечно), эвтаназии с передозировкой натрия фенобарбитала (25 мг / кг, внутривенно) и перфузии transcardially 0,1 М PBS пока полностью обескровлены. Далее следуют 4% параформальдегида решение в PBS в течение 5 мин (~ 1 литр).
Часть 2: удаление глазного яблока из орбитальной полости
- Для облегчения доступа к глазному яблоку, рекомендуется сначала удалить мозга. Как только мозг был удален тонкостенных орбиту кости очевидны. Используйте кости rongeurs медленно постепенно избавляться от стенки глазницы. Срежьте глазных мышц с помощью скальпеля и удалить из соединительной ткани глазного яблока. Аккуратно вырежьте зрительного нерва, это может быть использовано в электронной микроскопии. Глазное яблоко должно быть освобождено от орбитальной полости.
Часть 3: Рассеките сетчатку от наглазник
- Место глаза в чашку Петри с PBS держать сетчатку от высыхания. Рассекает микроскоп или увеличительное стол монтируется свет стоять полезно в рассечение, но не является необходимостью. Удалить роговицы за счет сокращения склеры близко к периметру роговицы на уровне ора Серрата с парой весной ножницами и удалить объектив с щипцами.
- Используйте кисть, пинцет, ножницы и весной, чтобы удалить сетчатку от склеры. Это делается путем разделения сетчатку от склеры и резки склеры покончить с ножницами. Надо осуществлять этот процесс с небольшим шагом, чтобы не повредить или порвать ткани сетчатки. Склеры не легко отделить от остатков зрительного нерва так тщательно вырезать склеры вокруг зрительного нерва.
- На данный момент сетчатки сохранил свою изогнутую форму и должен быть плоский для отбора проб. Перед уплощение сетчатки, стекловидного тела, которая имеет консистенцию желе, могут быть удалены в комок. Чтобы сгладить сетчатки на слайд, сделать несколько радиальных разрезов с лезвие скальпеля. Остаточные юмора стекловидного теперь могут быть удалены с помощью обычного фильтровальную бумагу и кисти. Сетчатки слой ганглиозных клеток подвергается в этой точке, так что необходимо быть нежным, когда удаление стекловидного тела. Если зрительный нерв до сих пор приводится в оптический диск, удалите зрительного нерва без предыдущего извлечения сетчатке использованием лезвие скальпеля и пары весной ножницами. Теперь это плоская гора сетчатки (рис. 1) и ямки должно быть очевидно, как темное пятно в височной / вентральной направлении от диска зрительного нерва.
Часть 4: Отбор проб
- Есть несколько вариантов для отбора проб сетчатки. Здесь мы опишем flatmount подготовки и isodentric выборки. Для обеих процедур flatmount сетчатки с оптической слой волокна от слайда. Если намерение заключается в изучении клеточного слоя сетчатки ганглия в flatmount подготовки, необходимо удалить или отбеливателя пигментный эпителий. Чтобы удалить пигментный эпителий использовать кисть слегка, чтобы удалить часть этого слоя, это приводит к повреждению фоторецепторов слоя. Отбеливание включает замачивание сетчатки в раствор перманганата калия (0,25%) в течение 1 часа, стиральная в дистиллированной воде, а также очистка в щавелевой кислоты (5%) в течение 5 минут 2.
- Если намерение заключается в изучении распределения клеток и морфология каждого слоя всей сетчатке, то мы предлагаем изометрической выборки сетчатки. Сетчатке должно быть flatmounted на слайде влажной, с PBS. Для изометрической выборки нарезать небольшими кусками ткани на равном расстоянии от диска зрительного нерва в носовой, временных, верхней и нижней стороны (рис. 1). Это не обязательно, чтобы отбелить пигментный эпителий в этой подготовке. Эти произведения теперь могут быть секционного в корональной плоскости с криостата, vibratome или ультрамикротоме в зависимости от исследования вопроса. Для криостат секционирования, части должны быть cryoprotected в 30% сахарозы в ночное время и замороженных в контексте установки среды на сухой лед. Кроме того, образцы могут быть внедрены в агар и нарезанная на vibratome. Криостата и vibratome препаратов будет надежно выход разделы, как тонкий, как 4 м. Если тоньше разделы необходимы (например, для подготовки электронного микроскопа), необходимо подготовить образцы для ультрамикротоме. Чтобы сделать это, разделы должны быть после зафиксировано в осмия в течение 1 часа под fumehood. Это сопровождается обезвоживанием в серии градуированных этанола (50, 70, 95, 95, 100, 100%) и 100% пропилена. ТканиЗатем встроенный в Epon (EMBED-812 вложение комплект).
Часть 5: Представитель Результаты:
В нашей лаборатории мы ежедневно выполняют иммуногистохимии на cryosectioned сетчатки (рис. 2). В этом случае мы заинтересованы в isodensity каннабиноидных рецепторов (CB1) на приматах сетчатки. Мы также рассмотрим последствия пренатального воздействия этанола на приматов зрительной системы. С этой целью, мы заинтересованы в ячейке плотности и толщины слоя в центральной ямке и в периферической сетчатке. Чтобы достичь этого, мы вкладываем части сетчатки в Epon, нарежьте на 700 нм на ультрамикротоме, и пятна с 1% толуидиновым синим (рис. 3).
Рисунок 1 Flatmount сетчатки. Радиальные сокращения используются для выравнивания сетчатки.
Рисунок 2 Иммуноокрашивание. Cryosection периферической сетчатки immunostained для CB1 где ганглиозных клеток сетчатки в значительной степени помечены некоторые маркировке на внутренней и внешней ядерной слоев. Толщина этого раздела составляет 14 м и витражи на слайде. RG - слой сетчатки ганглия; IP - внутренний слой плексиформные; В - внутренний ядерный слой; OP - внешний слой плексиформные; ON - наружный ядерный слой.
Рисунок 3 Fovea. Раздел через ямки, что было заложено в Epon и нарезанный на ultramicrotrome на 700 нм. Фоторецепторов слой (PR) было использовано для выравнивания разделов. Обратите внимание, что на всем протяжении фоторецепторов может быть идентифицирован указывает соответствующий угол в поперечной плоскости. Плотность измерения были проведены на 300 м, 500 м и 800 м от центра фовеа яму использованием Bioquant системы обработки изображений.
RG - слой сетчатки ганглия; IP - внутренний слой плексиформные; В - внутренний ядерный слой; OP - внешний слой плексиформные; ON - наружный ядерный слой; шкалы = 50 м
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Подготовка сетчатки как wholemount позволяет анализ топографии и пространственного распределения либо слой ганглиозных клеток или эндотелиальных клеток кровеносных сосудов сетчатки 3. Количественная оценка плотности клеток на периферии сетчатки приматов легко осуществить. Однако, в perifoveal и фовеальной регионов, укладки нескольких слоев в слое ганглиозных клеток препятствует количественной оценке. Чтобы обойти эту потенциальную предвзятость, ямки и perifoveal регионе можно разрезать от wholemount подготовк...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Ikiel Ptito за его техническую поддержку. Мы благодарны Франк Эрвин, Роберта Palmour и сотрудники Фонда поведенческих наук лаборатории расположены в Сент-Китс, Вест-Индии, за их постоянную поддержку нашей работы приматов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Скальпель | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Лезвия для скальпеля | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Пружинные ножницы | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Ножницы | Fine Science Tools | 14090-11 | Подойдут любые хирургические ножницы |
| Кусачки (ронжёры) | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Пинцет | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Фильтровальная бумага | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Кисть из верблюжьего или соболиного волоса | Любой поставщик |
Ссылки
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
