Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стандартизированные Подготовка одноклеточных суспензий от мыши легочной ткани использованием gentleMACS диссоциатор

34.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1266

⸱

2 июля 2009 г.

 ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec,GmbH

В этой статье

Краткое содержание

Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для агитации ткани для получения большого количества жизнеспособных, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на легочной ткани объясняется.

Аннотация

Подготовка одноклеточных суспензий из тканей является важной предпосылкой для многих экспериментов в сотовых исследований. Процесс диссоциации целые органы требует специфических параметров, чтобы получить большое количество жизнеспособных клеток в воспроизводимым образом. GentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. Инструмент содержит предварительно запрограммированными настройками, которые оптимизированы для эффективной, но нежный диссоциации различных типов тканей, в том числе мыши легких. В этой публикации использование диссоциатор gentleMACS на легочную ткань производным от мышей показано.

Протокол

Для работы в стерильных условиях, то рекомендуется выполнять все шаги в ламинарном боксе.

1. Материалы

  1. HEPES буфера: 10 мМ HEPES-NaOH рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,8 мМ CaCl 2)
  2. Коллагеназа D решение: Коллагеназа D: 100 мг / мл (коллагеназы D> 0,15 ЕД / мг), в HEPES буфере
  3. Я ДНКазы решение: 20000 Ед / мл ДНКазы I
  4. PBS буфере при рН 7,2
  5. PEB буфера: 1 часть маточного раствора BSA в 20 частях autoMACS Промывка решения
  6. Ткани: легкие производным от 6 / 7 недель старой взрослой самки BALB / C мышей, свободных от прилегающих органов.
  7. Дополнительно: CD11c микрошарики, MACS MS Столбцы MACS сепаратор для выделения дендритных клеток из мышиных легких одной клеточной суспензии

2. Диссоциирующего легочной ткани

  1. Промойте ткань в чашке Петри содержащие PBS для удаления эритроцитов.
  2. Передача максимум 450 мг ткани легкого для труб gentleMACS С, содержащего 4,9 мл HEPES буфера.
  3. Добавить 100 мкл Коллагеназа D решение конечной концентрации 2 мг / мл коллагеназы D.
  4. Добавьте 10 мкл ДНКазы я решение для до 150 мг ткани (конечная концентрация 40 ед / мл ДНКазы I) или 20 мкл ДНКазы я за 150-450 легочной ткани мг (конечная концентрация 80 ЕД / мл ДНКазы I).
  5. Плотно закрыть трубы С и прикрепить его на диссоциатор gentleMACS. Затем запустите программу "m_lung_01".
  6. Инкубируйте в течение 30 мин при 37 ° C с автоматическим вращением или вручную поворотом каждые 5 мин.
  7. Вернуться образца диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_lung_02".

3. Фильтрация

  1. Подготовка 50 мл трубки для сбора отфильтрованных ячеек, заменив шапка с 70 мкм сито ячейки сетки.
  2. После второй программе gentleMACS концов, в зависимости от распределения материала образца в трубке, вы можете центрифуге трубки кратко собрать образцы материала в нижней части трубы.
  3. Удалить клеток через перегородку запечатанном крышкой трубки С помощью подходящего 1000 мкл кончика пипетки и применять их в ячейки фильтра.
  4. Вымойте ячейки фильтра с 5 мл HEPES буфера при комнатной температуре.
  5. Центрифуга клетки осадок в 50 мл трубки на 300xg течение 10 мин.
  6. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в желаемом объеме буфера PEB.

Часть 4: Представитель Результаты:

figure-protocol-1
Рисунок 1. Легкого диссоциации с gentleMACS ™ диссоциатор привело к 92% жизнеспособных клеток. Мертвые клетки флуоресцентно окрашенных пропидий йодида (PI) (право сюжет точку; левый участок точка: нет окрашивания PI).

figure-protocol-2
Рисунок 2. Диссоциация мыши легочной ткани с использованием результатов gentleMACS диссоциатор в высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Производных одноклеточных суспензий окрашивали CD45-PE и CD146-FITC или CD31-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Single-клеточной суспензии производным от мыши легочной ткани окрашивали CD11c-FITC и Анти-mPDCA-1-APC для обнаружения мыши CD11c низкий м-PDCA-1 + plasmacytoid контроллеров домена, а также высокой CD11c клеток.


figure-protocol-4
Рисунок 4. Обогащение дендритных клеток с использованием CD11c микрошарики, сепаратор MiniMACS и два MS Столбцы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом видео, мы вводим новый метод диссоциации легочной ткани мыши. Мы показали, что сочетание механических и ферментативных лечения легочной ткани дали высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. В частности, механические распада тканей было достигнуто за счет диссоциатор gentleMACS. GentleMACS C Трубы включают ротор - статор системы, которая отделяет ткани в смягченной форме. Процедура контролируется программой настройки инструмента. Параметры были оптимизированы для достижения высокой урожайно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы являются сотрудниками компании Miltenyi Biotec GmbH, которая производит прибор, используемый в данной статье.

Благодарности

Авторы являются сотрудниками Miltenyi Biotec GmbH, Германия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
С-пробиркиMiltenyi BiotecКат. № 130-093-237http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Стартовый наборMiltenyi BiotecАрт. № 130-093-235http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Ротатор для пробирокMiltenyi BiotecАртикул № 130-090-753http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Промывочный растворMiltenyi BiotecАрт. № 130-091-222<а href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® стоковый раствор БСАMiltenyi Biotec№ заказа 130-091-376http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec№ заказа 130-052-001http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PEMiltenyi BiotecАртикул № 130-092-026130-091-830http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APCMiltenyi Biotec№ заказа 130-091-963http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITCMiltenyi BiotecАртикул № 130-092-026http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PEMiltenyi BiotecАрт. № 130-091-610http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Раствор пропидия иодидаMiltenyi Biotec№ заказа 130-093-233http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Наконечники для дозаторов Art 1000 ReachМолекулярные биопродукты№ заказа 2079http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<Для работы в стерильных условиях рекомендуется выполнять все этапы в ламинарном шкафу. 1. Материалы Буфер HEPES: 10 мМ HEPES-NaOH pH 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1,8 мМ CaCl2 Раствор коллагеназы D: коллагеназа D: 100 мг/мл (коллагеназа D > 0,15 Ед/мг) в буфере HEPES Раствор ДНКазы I: 20 000 Ед/мл ДНКазы I Фосфатно-солевой буфер (PBS) при pH 7,2 Буфер PEB: 1 часть стокового раствора БСА в 20 частях промывочного раствора autoMACS Ткань: легкое взрослой самки мыши линии BALB/C в возрасте 6/7 недель, очищенное от прилежащих органов. Дополнительно: CD11c MicroBeads, колонки MACS MS, сепаратор MACS для выделения дендритных клеток из суспензии одиночных клеток легкого мыши. 2. Диссоциация ткани легкого Промойте ткань в чашке Петри с PBS для удаления эритроцитов. Перенесите не более 450 мг ткани легкого в С-пробирку gentleMACS, содержащую 4,9 мл буфера HEPES. Добавьте 100 мкл раствора коллагеназы D до конечной концентрации 2 мг/мл коллагеназы D. Добавьте 10 мкл раствора ДНКазы I на каждые 150 мг ткани (конечная концентрация ДНКазы I 40 Ед/мл) или 20 мкл раствора ДНКазы I для массы ткани от 150 до 450 мг (конечная концентрация ДНКазы I 80 Ед/мл). Плотно закройте С-пробирку и закрепите ее в диссоциаторе gentleMACS. Запустите программу «m_lung_01». Инкубируйте в течение 30 мин при 37°C с автоматическим вращением или перемешиванием вручную каждые 5 мин. Снова поместите образец в диссоциатор gentleMACS и запустите программу «m_lung_02». 3. Фильтрация Подготовьте пробирку объемом 50 мл для сбора отфильтрованных клеток, заменив крышку на клеточный фильтр с ячейками 70 мкм. После завершения второй программы gentleMACS, в зависимости от распределения материала в пробирке, можно кратковременно центрифугировать ее для осаждения материала на дне. Извлеките клетки через герметичную перегородку крышки С-пробирки с помощью подходящего наконечника дозатора на 1000 мкл и перенесите их на клеточный фильтр. Промойте клеточный фильтр 5 мл буфера HEPES при комнатной температуре. Центрифугируйте клетки до образования осадка в пробирке объемом 50 мл при 300xg в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в нужном объеме буфера PEB. Часть 4: Репрезентативные результаты Рисунок 1. Диссоциация легкого с помощью диссоциатора gentleMACS™ обеспечила жизнеспособность клеток на уровне 92%. Мертвые клетки были окрашены флуоресцентным красителем пропидиййодидом (PI) (правый график рассеяния; левый график рассеяния: без окрашивания PI). Рисунок 2. Диссоциация ткани легкого мыши с использованием диссоциатора gentleMACS приводит к получению высокого процента жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Полученные суспензии одиночных клеток были окрашены CD45-PE и CD146-FITC или CD31-FITC и проанализированы методом проточной цитометрии. Рисунок 3. Суспензия одиночных клеток, полученная из ткани легкого мыши, была окрашена CD11c-FITC и Anti-mPDCA-1-APC для обнаружения плазмоцитоидных дендритных клеток мыши CD11clow m-PDCA-1+, а также клеток CD11chigh. Рисунок 4. Обогащение дендритными клетками с использованием CD11c MicroBeads, сепаратора MiniMACS и двух колонок MS.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

Ссылки

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

суспензия одиночных клетокраствор коллагеназы Dраствор ДНКазы Iклеточный фильтр 70 мкманализ методом проточной цитометриилейкоцитарные эндотелиальные клеткипротокол диссоциации тканейоценка жизнеспособности клеток
Стандартизированные Подготовка одноклеточных суспензий от мыши легочной ткани использованием gentleMACS диссоциатор
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.