$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Для работы в стерильных условиях, то рекомендуется выполнять все шаги в ламинарном боксе.
1. Материалы
- HEPES буфера: 10 мМ HEPES-NaOH рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,8 мМ CaCl 2)
- Коллагеназа D решение: Коллагеназа D: 100 мг / мл (коллагеназы D> 0,15 ЕД / мг), в HEPES буфере
- Я ДНКазы решение: 20000 Ед / мл ДНКазы I
- PBS буфере при рН 7,2
- PEB буфера: 1 часть маточного раствора BSA в 20 частях autoMACS Промывка решения
- Ткани: легкие производным от 6 / 7 недель старой взрослой самки BALB / C мышей, свободных от прилегающих органов.
- Дополнительно: CD11c микрошарики, MACS MS Столбцы MACS сепаратор для выделения дендритных клеток из мышиных легких одной клеточной суспензии
2. Диссоциирующего легочной ткани
- Промойте ткань в чашке Петри содержащие PBS для удаления эритроцитов.
- Передача максимум 450 мг ткани легкого для труб gentleMACS С, содержащего 4,9 мл HEPES буфера.
- Добавить 100 мкл Коллагеназа D решение конечной концентрации 2 мг / мл коллагеназы D.
- Добавьте 10 мкл ДНКазы я решение для до 150 мг ткани (конечная концентрация 40 ед / мл ДНКазы I) или 20 мкл ДНКазы я за 150-450 легочной ткани мг (конечная концентрация 80 ЕД / мл ДНКазы I).
- Плотно закрыть трубы С и прикрепить его на диссоциатор gentleMACS. Затем запустите программу "m_lung_01".
- Инкубируйте в течение 30 мин при 37 ° C с автоматическим вращением или вручную поворотом каждые 5 мин.
- Вернуться образца диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_lung_02".
3. Фильтрация
- Подготовка 50 мл трубки для сбора отфильтрованных ячеек, заменив шапка с 70 мкм сито ячейки сетки.
- После второй программе gentleMACS концов, в зависимости от распределения материала образца в трубке, вы можете центрифуге трубки кратко собрать образцы материала в нижней части трубы.
- Удалить клеток через перегородку запечатанном крышкой трубки С помощью подходящего 1000 мкл кончика пипетки и применять их в ячейки фильтра.
- Вымойте ячейки фильтра с 5 мл HEPES буфера при комнатной температуре.
- Центрифуга клетки осадок в 50 мл трубки на 300xg течение 10 мин.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в желаемом объеме буфера PEB.
Часть 4: Представитель Результаты:
Рисунок 1. Легкого диссоциации с gentleMACS ™ диссоциатор привело к 92% жизнеспособных клеток. Мертвые клетки флуоресцентно окрашенных пропидий йодида (PI) (право сюжет точку; левый участок точка: нет окрашивания PI).
Рисунок 2. Диссоциация мыши легочной ткани с использованием результатов gentleMACS диссоциатор в высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Производных одноклеточных суспензий окрашивали CD45-PE и CD146-FITC или CD31-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии.
Рисунок 3. Single-клеточной суспензии производным от мыши легочной ткани окрашивали CD11c-FITC и Анти-mPDCA-1-APC для обнаружения мыши CD11c низкий м-PDCA-1 + plasmacytoid контроллеров домена, а также высокой CD11c клеток.
Рисунок 4. Обогащение дендритных клеток с использованием CD11c микрошарики, сепаратор MiniMACS и два MS Столбцы.