Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для ткани aggitation получить большой объем жизнеспособной, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на nerual тканей объясняется.
Методическая статья
Генерация одноклеточных суспензий от мыши нервной ткани
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В нервной системе, сотни нейронов и глиальных типов клеток были описаны. Каждый конкретный тип клеток в головной или спинной мозг имеет репертуар поверхности клетки молекулы или молекулярные детерминанты, с помощью которого он может быть идентифицированы и охарактеризованы. В настоящее время, надежной идентификации клеток и разделения технологии требуют одноклеточных подготовки, которые будут созданы одновременно ограничивающий клеточной смерти и разрушения характеристика поверхности белка. GentleMACS диссоциатор, при использовании в сочетании с трипсином или папаин основе диссоциации комплекты, могли бы эффективно и аккуратно отделить ткани мозга при сохранении антиген эпитопов и ограничивая потерю клеток. Стандартизированные подготовка одноклеточных суспензий достигается с помощью C Трубы и оптимизированы, заданных программ gentleMACS. После генерируется, одноклеточных суспензий можно лечить с помощью моноклональных конъюгатов, как Anti-Prominin-1 микрошарики, которые идентифицируют нейронных предков, или очищенной дальнейшего использования бисера Миелин удаления.
Протокол
Для работы в стерильных условиях, то рекомендуется выполнять все шаги в ламинарном боксе.
1. Материалы
- Нервной ткани Диссоциация Kit (P) (Компоненты: 1,2 Решение, 3 и 4, хранения буфера)
- Предварительное разделение Фильтры
- (Дополнительно) Бисер Миелин удаления
- Бета-меркаптоэтанол
- gentleMACS диссоциатор
- С трубы
- MACSmix труб Rotator
- HBSS (в / м)
- HBSS (ш)
- Подготовьте следующие решения до начала протокола:
- Буферизацией Соль Хэнкса Решение без двухвалентных катионов Са 2 + или Mg 2 + (HBSS (в / м)
- HBSS, стандартный, т.е. с Ca 2 + и Mg 2 + (HBSS (ш)
- В зависимости от антиген эпитоп заинтересованность в дальнейших приложений, использовать либо Папаин основе нервной ткани Диссоциация Kit (P) или трипсина основе нервной ткани Диссоциация Kit (T).
- Подготовьте следующие решения от нервной ткани Диссоциация Kit:
- Решение 2: добавить бета-меркаптоэтанола в 0,067 мМ
- Решение 4: растворить порошок в 0,7 мл буфера хранения (поставляется в комплекте), аккуратно перемешать (не вихря)
- Фермент Смешайте 1: Внесите 1,9 мл раствора 2 и 50 мкл раствора 1 (как из комплекта) на трубы С и выдержать в течение 10-15 минут при температуре 37 ° C. Этого достаточно, чтобы отделить 400 мг ткани головного мозга.
2. Диссоциирующего нервной ткани
- Взвесьте мозговой ткани в пробирку, содержащую 1 мл HBSS (в / м)
- Передача мозга мыши в трубку С, содержащий 1950 мкл предварительно нагретую Mix фермента 1. (ПРИМЕЧАНИЕ: этот протокол написан для ≤ 400 мг, но решение объемы могут быть расширены для размещения до 1600 мг мозговой ткани в трубы C)
- Место труба C на диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_brain_01".
- Инкубируйте с вращением (4 мин использованием Rotator MACSmix Tube) в течение 15 мин при 37 ° C.
- Место труба C на диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_brain_02".
- На этапе подготовки диссоциации 30 мкл ферментного Mix 2 на 400 мг ткани, аккуратно смешивания 20 мкл раствора 3 и 10 мкл раствора 4.
- Добавить ферментов Mix 2 до станции метро С помощью перегородки уплотнением крышки и аккуратно перемешать без вортексе.
- Инкубируйте труба C с вращением в течение 10 мин при 37 ° C в инкубаторе.
- Место труба C на диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_brain_03".
- Инкубируйте труба C с вращением в течение 10 мин при 37 ° C в инкубаторе.
- Центрифуга кратко собрать образцы в нижней части трубы.
3. Фильтрация
- Выбор фильтра достаточно большой, чтобы позволить переход к клеткам интерес. Например, клетки Пуркинье являются слишком большими, чтобы пройти через 30 мкм фильтр, но Prominin-1 + клетки.
- Используйте suitable1000 мкл пипетки, чтобы удалить клетки образуют трубки С через перегородку уплотнением крышки и применить его к Предварительное разделение Фильтр по 15 мл пробирки. (ПРИМЕЧАНИЕ: для увеличения размеров выборки использовать 50 мл пробирки).
- Промойте фильтр 10 мл HBSS (W).
- Центрифуга отфильтрованных ячеек при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют supernatent в вашей среде или буфера выбора для последующего применения.
- Для удаления миелина мусора, использовать бисер Миелин удаления.
4. Представитель Результат: Пожалуйста См. рисунки 1-3
Рис. 1 мозг диссоциации с диссоциатор gentleMACS привело к 97% жизнеспособных клеток, а проточной цитометрии показывает анализ.
Рис. 2 Легкий картина микроскопа neurosphere образование после магнитной сортировки клеток с использованием Anti-Prominin-1 микрошарики через 7 дней культивирования в MACS ® NeuroMedium дополнен MACS Дополнение B27 PLUS. Клетки были получены из CD1 мозга мыши (P3) с помощью нервной ткани Диссоциация Kit (Р).
Рис. 3 Миелин мусор в одно-клеточные суспензии значительно ухудшает изолятор, и удаление миелина мусора бисером Миелин удаление увеличивает эффективность разделения клетки. Для MACS Цветоделение использованием Anti-Prominin-1 микрошарики, P22 мозга мыши был диссоциированных использованием нервной ткани Диссоциация Kit (Р). Клетки из одной клеточной суспензии были либо непосредственно используется для разделения, или были представлены миелина истощения использованием бисера Миелин удаления. Сравнение отделение от образцов без и с удалением миелина, показывает, что чистота выше для образцов с предыдущим удаление миелина.
Обсуждение
GentleMACS диссоциатор облегчает подготовку стандартизированных одноклеточных суспензий из нервной ткани в замкнутой системе. Нервной ткани Диссоциация Комплекты оптимизированы для сохранения антиген эпитопов, необходимых для дальнейшего приложения, такие как immunostainings и иммуномагнитный разделения ячейки 1-5. В этом протоколе мы показываем нежный ферментативной диссоциации мыши мозга с помощью gentleMACS диссоциатор и нервной ткани Диссоциация Kit (P), уступив в 97% жизнеспособных клеток. 100 мг нейронных дает ткани между 6 и 5x10 1x10 7 ячеек, в зависимости от возраста тканей хозяина. Целевых Prominin-1 + клетки были изолированы с использованием анти-Prominin-1 микрошарики и впоследствии приняты в культуру. Протокол показано, что еще более эффективным с дополнительным использованием бисера Миелин удаление при работе с нервной ткани основе P7 мышей>.
Раскрытие информации
Авторы являются сотрудниками Miltenyi Biotec GmbH, Германия.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| С-пробирки | Miltenyi Biotec | Номер заказа 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| gentleMACS™ Стартовый набор | Miltenyi Biotec | Арт. № 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| MACSmix™ Ротатор для пробирок | Miltenyi Biotec | Номер заказа 130-090-753 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
| Набор для диссоциации нервной ткани (P) | Miltenyi Biotec | № заказа 130-092-628 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| Фильтры для предварительного разделения | Miltenyi Biotec | № заказа 130-041-407 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx |
| Микросферы Anti-Prominin-1 MicroBeads | Miltenyi Biotec | № заказа 130-092-333 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx |
| Анти-Prominin-1-APC | Miltenyi Biotec | № заказа 130-092-335 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx |
| Сорбирующие частицы для удаления миелина | Miltenyi Biotec | № заказа 130-094-544 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx |
| Наконечники для дозаторов Art 1000 с увеличенной длиной (Reach) | Молекулярные биопродукты | № заказа 2079 | http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<Для работы в стерильных условиях рекомендуется выполнять все этапы в ламинарном шкафу. 1. Материалы Набор для диссоциации нервной ткани (P) (компоненты: растворы 1, 2, 3 и 4, буфер для хранения) Фильтры для предварительной сепарации (опционально) Сорбирующие частицы для удаления миелина (Myelin Removal Beads) Диссоциатор gentleMACS Пробирки C Tube Ротатор пробирок MACSmix HBSS (без двухвалентных катионов) HBSS (с двухвалентными катионами) Перед началом протокола приготовьте следующие растворы: Раствор Ханкса сбалансированной солевой среды без двухвалентных катионов Ca2+ или Mg2+ (HBSS (w/o)) Стандартный раствор Ханкса сбалансированной солевой среды, т. е. с Ca2+ и Mg2+ (HBSS (w)) В зависимости от эпитопа антигена, интересующего в последующих приложениях, используйте либо набор для диссоциации нервной ткани на основе папаина (P), либо набор на основе трипсина (T). Приготовьте следующие растворы из набора для диссоциации нервной ткани: Раствор 2: добавьте бета-меркаптоэтанол до концентрации 0,067 мМ. Раствор 4: растворите порошок в 0,7 мл буфера для хранения (входит в состав набора), осторожно перемешайте (не используйте вортекс). Ферментальная смесь 1: внесите пипеткой 1,9 мл раствора 2 и 50 мкл раствора 1 (оба из набора) в пробирку C Tube и инкубируйте в течение 10–15 мин при 37 °C. Этого объема достаточно для диссоциации 400 мг ткани мозга. 2. Диссоциация нервной ткани Взвесьте ткань мозга в пробирке, содержащей 1 мл HBSS (w/o). Перенесите мозг мыши в пробирку C Tube, содержащую 1950 мкл предварительно нагретой ферментальной смеси 1. (ПРИМЕЧАНИЕ: данный протокол рассчитан на массу ≤ 400 мг, однако объемы растворов могут быть масштабированы для обработки до 1600 мг ткани мозга на одну пробирку C Tube). Поместите пробирку C Tube в диссоциатор gentleMACS и запустите программу «m_brain_01». Инкубируйте с перемешиванием (4 об/мин с помощью ротатора пробирок MACSmix) в течение 15 мин при 37 °C. Поместите пробирку C Tube в диссоциатор gentleMACS и запустите программу «m_brain_02». Во время этапа диссоциации приготовьте 30 мкл ферментальной смеси 2 на каждые 400 мг ткани, осторожно смешав 20 мкл раствора 3 и 10 мкл раствора 4. Добавьте ферментальную смесь 2 в пробирку C Tube через крышку с септой и аккуратно перемешайте без использования вортекса. Инкубируйте пробирку C Tube с перемешиванием в течение 10 мин при 37 °C в инкубаторе. Поместите пробирку C Tube в диссоциатор gentleMACS и запустите программу «m_brain_03». Инкубируйте пробирку C Tube с перемешиванием в течение 10 мин при 37 °C в инкубаторе. Кратковременно центрифугируйте для осаждения образца на дно пробирки. 3. Фильтрация Выберите фильтр с достаточно большим размером пор, чтобы через него могли пройти интересующие клетки. Например, клетки Пуркинье слишком велики для прохождения через фильтр 30 мкм, в то время как клетки Prominin-1+ проходят. С помощью подходящего дозатора на 1000 мкл извлеките клетки из пробирки C Tube через крышку с септой и перенесите их на фильтр для предварительной сепарации, установленный на пробирку для сбора объемом 15 мл. (ПРИМЕЧАНИЕ: для больших объемов образцов используйте пробирку для сбора объемом 50 мл). Промойте фильтр 10 мл HBSS (w). Центрифугируйте отфильтрованные клетки при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте супернатант в выбранной вами среде или буфере для последующего применения. Для удаления остатков миелина используйте сорбирующие частицы Myelin Removal Beads. 4. Репрезентативные результаты: см. рисунки 1–3 Рисунок 1. Диссоциация мозга с использованием диссоциатора gentleMACS обеспечила жизнеспособность клеток 97%, что подтверждается данными проточной цитометрии. Рисунок 2. Снимок нейросфер при световом микроскопе после магнитного сортинга клеток с использованием микросфер Anti-Prominin-1 MicroBeads после 7 дней культивирования в среде MACS® NeuroMedium с добавлением MACS Supplement B27 PLUS. Клетки были выделены из мозга мышей линии CD1 (P3) с помощью набора для диссоциации нервной ткани (P). Рисунок 3. Остатки миелина в суспензиях из единичных клеток значительно затрудняют изоляцию клеток; удаление миелина с помощью Myelin Removal Beads повышает эффективность сепарации клеток. Для сепарации MACS с использованием микросфер Anti-Prominin-1 MicroBeads мозг мыши P22 был диссоциирован с помощью набора для диссоциации нервной ткани (P). Клетки из суспензии единичных клеток либо использовались непосредственно для сепарации, либо подвергались удалению миелина с помощью Myelin Removal Beads. Сравнение сепарации образцов без удаления миелина и с его удалением демонстрирует, что чистота выше в образцах, прошедших предварительное удаление миелина.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html |
| Набор для диссоциации нервной ткани (T) | Miltenyi Biotec | № заказа 130-093-231 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| Раствор пропидийиодида | Miltenyi Biotec | № заказа 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
Ссылки
- Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
- Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
- Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
- Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
- Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
Перепечатки и разрешения
