$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Перед тем как начать
Взрослые сердца
- Недавно подготовить искусственные гемолимфы (АГ) раствор, содержащий 108 Na +, 5 мМ К +, 2 мМ Ca 2 +, 8 мм MgCl 2, 1 мМ NaH 2 4 PO, 4мм NaHCO 3, 10 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES (рН 7,1, все реагенты из Sigma Chemicals). Сахарозы и трегалозу должны быть добавлены к AH из холодильника растворы непосредственно перед использованием, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
- Принесите AH до комнатной температуры и кислородом раствор воздух-барботажных в течение 15 мин.
- Потяните несколько тонких капиллярах (например, стеклянные капилляры, 100 мкл, VWR), необходимые для удаления жира.
Личинки сердца
- Sylgard покрытием покровные: с помощью зубочистки, передачи о 50-70μl решения Sylgard на 22x22mm покровное. Пусть Sylgard затвердевают при температуре 65 ° C в течение ночи.
- Подготовка Broadie и буферных БАТЭ (135 мм NaCl, 5 мМ KCl, 4мм MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5мм ТЭС, 36мм сахароза;. РН 7,15 см. Broadie и БАТЭ, 1993).
- Подготовка инструментов, необходимых для выполнения histoacryl клея. Во-первых, вытащить несколько тонких капиллярах (например, наука Продукты GB100T8P). Подключите 1,5 мл кончика пипетки с небольшим пластикового шланга (Tygon, 1 / 32 "), вставляя меньше конец в трубку. Вставьте капилляр с его широкое отверстие на другом конце. Нагрузка капилляр с Histoacryl клея путем погружения в капиллярной капли клея и нежным всасывания в пластиковый наконечник. При работе с клеем необходимо иметь второй стеклянный капилляр под рукой, чтобы удалить чрезмерное клей от кончика клей капилляра. Клей жидкий, пока не вступает в контакт с буферным раствором, где он будет затвердевать в течение нескольких секунд. Однако, как правило, остается пластиковая достаточно долго, чтобы быть удалены из клея капиллярного кончика или при применении его в образец.
Полу-нетронутыми дрозофилы Сердце из взрослых Fly
- Взрослые мухи дрозофилы анестезировали Fly Nap (Каролина Биологические Поставка °) в течение 2-5 минут. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не оставить летит в Fly Nap для длинных выдержках. Краткосрочное воздействие холода может быть также использован для обезболивания мухи, но CO 2 не рекомендуется, поскольку она имеет более прочного влияния на частоту сердечных сокращений и ритмичность.
- Наркозом мухи помещается, сверху вниз, в чашке Петри покрыты тонким слоем вазелина. Гидрофобные кутикулы в крылья и тело обратимо "прилипать" к желе, но летать можно переместить в случае необходимости. Это становится особенно важным во время последующих манипуляций.
- Начальный разрез с использованием изогнутые ножницы весной (Roboz # 5611). Ножниц находятся под ноги и угловые вниз к дорсальной поверхности грудной клетки возле шеи. Головы, брюшной нервной цепочки, и ноги будут удалены с одного разреза. Препарат затем погружен в кислородом, искусственная гемолимфы (АГ) решение.
- Использование весной ножницы заднем конце брюшка (состоит из сегментов брюшка 7 и 8) удаляется с одного разреза. Это обеспечивает доступ для изготовления боковых разрезов по обоим краям брюшной полости и служит, чтобы разорвать связь между задней кишки и брюшной кутикулы. Освободил лоскут брюшной брюшной кутикулу удаляют.
- В шагах 3 и 4 передних и задних связи кишки порваны так органах брюшной полости в настоящее время удерживается на месте только tracheols. Кишечнике и других органах брюшной полости обычно могут быть удалены как единую массу использованием щипцов ювелирного (Roboz, # 55) и нежный дергать. Удаление внутренних органов показывает, бьющееся сердце трубки еще привязаны к спинной кутикулы окружении жира тела.
- Жира тела довольно непрозрачным в световой микроскоп, следовательно, часто бывает необходимо удалить часть этого жира, чтобы увидеть сердце трубке отчетливо. Это достигается за счет использования техники липосакции мелко обращается стеклянных капилляров. Капилляры выполнены с использованием стандартной пипетки съемник (например Саттер Р-97 Внесите Puller) и затем вставляется в пластиковую трубку (Tygon, 1 / 16 "), подключенных к вакуум источник. Эта система используется для всасывания от лишнего жира со всего сердца трубки. Всасывающая сила пропорциональна диаметр кончика пипетки так с советами более 40 микрон в диаметре не должны использоваться. Экстремальный необходимо позаботиться, чтобы не касаясь самого сердца и потому, что задняя часть сердца является очень хрупким, что региону следует избегать вообще.
- Взрослого сердца дрозофилы трубки теперь подвергаются и должны биться. При необходимости кутикулы и придает сердце может быть повторно осторожно приподнимая кутикулы из вазелина и тщательно трамбовочные его обратно, снова избегая любых контактов с сердечной ткани. В тего точки решение купания подготовки должны быть заменены свежими АХЛ. Этот препарат следует допускать, чтобы уравновесить в течение 20-30 минут с кислородом до любых манипуляций. Если препарат будет поддерживаться в течение более 60 минут, он должен будет озарен свежие АХЛ.
Иммобилизации дрозофилы личинок для оптической записи
- Место каплю клея Histoacryl близко друг к углу покровные Sylgard. Добавить 50 мкл B & B буфер для клея капли, которые застынет на месте. Заполнить пространство между клееного пятна с B & B - клей будет держать буфера на слайде.
- Возьмите блуждающих L3 личинки и положите его на кусок мокрой бумаге ткани на льду в течение 2 мин. Это замедлит его движение. Затем перенесите личинки в буфер и ориентировать его спинной стороной вверх (это сторона личинки, что не хватает зубец ремни). Быстро применить некоторые клея между областью головы и Sylgard. Клей затвердеет очень быстро и не допустить глава личинку двигаться.
- Использование щипцов тщательно схватить животное задних дыхальца и мягко растянуть. Fix личинки в этом положении, применяя клей по обеим сторонам личинки в задней половине. Чтобы уменьшить дальнейшее движение кутикулу от мышц стенки тела, добавьте больше клея на флангах животного. Личинка сейчас фиксируется в этом положении. Покровное могут быть помещены в небольшой чашке Петри заполнены АХЛ или PBS. Сердце бьется теперь можно записать без помех от движения тела стены.
Представитель Результаты:
Полу-нетронутыми взрослых дрозофил сердце будет биться ритмично в течение нескольких часов следующих рассечение, когда сохраняется в свежей, насыщенной кислородом AH (см. Справочная данных, Ocorr и соавт., 2007). Типичный пример показан в фильме 1. Сердца из 3-го возраста личинки мух и молодых (1 - 3 недели после eclosion) обычно имеют регулярное сердцебиение по ставкам в диапазоне от 1 - 3 Гц. Мухи старше 3-х недель как правило, более аритмичный, тем не менее, эти сердца все еще в состоянии разбить спонтанно в течение нескольких часов в кислородом АХЛ. Сердца у взрослых мух, которые были повреждены в результате вскрытия процедура обычно показывают локализованных областей крайнего сужения, которые не могут расслабиться. Heartbeat ставки медленнее, чем 1 Гц, редко наблюдается у мух в возрасте до 3-недельного возраста, следовательно, такие препараты, как считается, быть повреждены и отбрасываются.
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 1. - одна неделя старого летать дикого типа взрослых (со штаммом 1118 лаборатории) с указанием подвергается брюшной трубки сердца (впереди слева). Обратите внимание, регулярные, ритмические сокращения. Непрозрачные регионов в верхнем правом углу находятся оставшиеся жира в брюшной полости органов; круглых клеток по обе стороны от сердца, перикарда клеток.